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你是路人甲銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染JURKAT細(xì)胞后，用G418篩選
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| 我正在用脂質(zhì)體2000做JURKAT細(xì)胞株轉(zhuǎn)染,用G418篩選后存貨或的細(xì)胞很少,同時這些細(xì)胞也不分裂增殖了，感覺也快死了.我準(zhǔn)備重新再做一次，這次打算先用PHA先把細(xì)胞株激活,再轉(zhuǎn)染,這樣能提高轉(zhuǎn)染效率嗎? |
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| 那樣做不能提高轉(zhuǎn)染效率,并且會使轉(zhuǎn)染后篩選更麻煩,激活后再轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的毒性會更明顯。轉(zhuǎn)染失敗的原因a:轉(zhuǎn)染時間過長,脂質(zhì)體的后續(xù)毒性很大,b:加G418過早;c:G418梯度設(shè)置不好;d:未轉(zhuǎn)進(jìn)去。我們實驗室用24孔板做，每孔2ulRFECT，設(shè)置siRNA終濃度10nM,30nM,50nM,100nM四個梯度，每個梯度做2個復(fù)孔，建議在轉(zhuǎn)染時一定要注意脂質(zhì)體的毒性,隨時觀察細(xì)胞狀態(tài),一旦細(xì)胞狀態(tài)變化要及時終止轉(zhuǎn)染,但轉(zhuǎn)染效率與轉(zhuǎn)染時間有一定的關(guān)系,太短的轉(zhuǎn)染時間會導(dǎo)致轉(zhuǎn)不進(jìn)去而轉(zhuǎn)染失敗,如果你的細(xì)胞比較耐受,你可以在嚴(yán)密監(jiān)視細(xì)胞的情況下盡量延長轉(zhuǎn)染時間。最好能設(shè)一個脂質(zhì)體的梯度,找到最佳脂質(zhì)體用量；延遲G418的加入時間,每一個G418濃度間隔時間延長 |
2樓2019-01-31 17:14:43
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