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pulldown實(shí)驗(yàn)樣品無法洗脫，陰性對(duì)照也呈陽(yáng)性
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大家好， 最近在做pulldown實(shí)驗(yàn)，用的是talon resin，可是發(fā)現(xiàn)不管是his的蛋白還是沒有his的蛋白都會(huì)和樹脂結(jié)合，并且很難洗脫下來（20ul 1m咪唑洗脫，洗下來很少，樹脂上還留有很多，猜測(cè)應(yīng)該是非特異性結(jié)合），我直接用樹脂和sdspage buffer煮沸跑膠，結(jié)果不管是實(shí)驗(yàn)組還是陰性對(duì)照組都有兩個(gè)條帶，這里想問一下什么原因?qū)е碌鞍谉o法洗脫，1，到白粘在樹脂上了，2，每次wash的時(shí)候總會(huì)有一點(diǎn)buffer和樹脂在一起不能全部去干凈。下面是大致的實(shí)驗(yàn)步驟， 1.準(zhǔn)備好10ul resin用loading buffer 洗3次， 2，上樣，50ug his蛋白與樹脂混合1h， 3.300ul washing buffer 洗3次，13000rpm 2min,每次去除上清，到樹脂與上清和界面處，為了不損失樹脂，剩余還有一些溶液. 4.上樣，50ug unhis tagged蛋白 與樹脂混合30min, 5,同步驟3. 6，剩余15ul buffer，加5ul 4x sds loading buffer 沸水浴3min， 7. sds page， 8.不管是實(shí)驗(yàn)組還是陰性對(duì)照都有兩個(gè)條帶， |
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2樓2023-05-13 22:14:46
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