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[求助]
細(xì)胞培養(yǎng)及WB實(shí)驗(yàn)求助
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各位大神，在下細(xì)胞培養(yǎng)小白，可否幫在下答一下疑解一下難，以下問題在網(wǎng)上也都有查過，但還想在這里討論交流一下，3Qs very much！ 一、細(xì)胞培養(yǎng) 我細(xì)胞培養(yǎng)的是hep3B，目前在6孔板里培養(yǎng)，想咨詢一下： 1、我在網(wǎng)上看6孔板細(xì)胞接種量是1.2*10^6，這個(gè)量憑經(jīng)驗(yàn)豐富的人員都不會(huì)去測(cè)的，這對(duì)于小白真的沒個(gè)譜，不過通過融合度來講，倒是可以有個(gè)宏觀概念，所以，這個(gè)接種量下，細(xì)胞融合度一般會(huì)是多少（20%、30%還是50%）？ 2、傳代時(shí)，網(wǎng)上有說融合度到80%-90%就可以了，如果收細(xì)胞體總蛋白時(shí)是不是得讓融合度100%時(shí)更合適？ 3、做RNAi或藥物處理時(shí)，一般細(xì)胞融合度90%時(shí)，進(jìn)行消化均分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組嗎？ 這中間不需要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎？ 4、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)一般什么條件下要求做？ 二、WB實(shí)驗(yàn)操作 1、收的細(xì)胞用 RIPA+PMSF 提完總蛋白，在上樣前加sds loading buffer的加熱，只是為了讓蛋白變性更充分嗎？ 在加loading前就煮，會(huì)造成什么情況，煮不也是使蛋白變性嗎？ 2、據(jù)我了解，有的需要加DTT或巰基乙醇，有的則不需要，什么情況下需要什么情況不需要呢？ 加DTT或巰基乙醇是跟loading一起加嗎？然后再煮樣 3、提完總蛋白，sds-page上樣有的會(huì)用各種方法定個(gè)量，但有的實(shí)驗(yàn)室會(huì)直接取出幾微升跑個(gè)長(zhǎng)膠，通過考染后顏色深淺再進(jìn)行上樣體積的調(diào)整，這樣一般 2-3次跑長(zhǎng)膠之后的調(diào)整，就可以將顏色調(diào)成一致，之后就可進(jìn)行后續(xù)的WB，這種操作是否嚴(yán)謹(jǐn)可靠？在這個(gè)研究領(lǐng)域是大家都認(rèn)得的操作嗎？ 4、WB的一抗是怎么選擇，二抗是怎么選擇呢？ |
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3樓2019-01-14 14:01:21
2樓2019-01-13 22:44:13
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