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[求助]
細胞培養(yǎng)及WB實驗求助
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各位大神，在下細胞培養(yǎng)小白，可否幫在下答一下疑解一下難，以下問題在網上也都有查過，但還想在這里討論交流一下，3Qs very much！ 一、細胞培養(yǎng) 我細胞培養(yǎng)的是hep3B，目前在6孔板里培養(yǎng)，想咨詢一下： 1、我在網上看6孔板細胞接種量是1.2*10^6，這個量憑經驗豐富的人員都不會去測的，這對于小白真的沒個譜，不過通過融合度來講，倒是可以有個宏觀概念，所以，這個接種量下，細胞融合度一般會是多少（20%、30%還是50%）？ 2、傳代時，網上有說融合度到80%-90%就可以了，如果收細胞體總蛋白時是不是得讓融合度100%時更合適？ 3、做RNAi或藥物處理時，一般細胞融合度90%時，進行消化均分實驗組和對照組嗎？ 這中間不需要進行細胞計數(shù)嗎？ 4、細胞計數(shù)實驗一般什么條件下要求做？ 二、WB實驗操作 1、收的細胞用 RIPA+PMSF 提完總蛋白，在上樣前加sds loading buffer的加熱，只是為了讓蛋白變性更充分嗎？ 在加loading前就煮，會造成什么情況，煮不也是使蛋白變性嗎？ 2、據我了解，有的需要加DTT或巰基乙醇，有的則不需要，什么情況下需要什么情況不需要呢？ 加DTT或巰基乙醇是跟loading一起加嗎？然后再煮樣 3、提完總蛋白，sds-page上樣有的會用各種方法定個量，但有的實驗室會直接取出幾微升跑個長膠，通過考染后顏色深淺再進行上樣體積的調整，這樣一般 2-3次跑長膠之后的調整，就可以將顏色調成一致，之后就可進行后續(xù)的WB，這種操作是否嚴謹可靠？在這個研究領域是大家都認得的操作嗎？ 4、WB的一抗是怎么選擇，二抗是怎么選擇呢？ |
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