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炸魚條yy新蟲 (初入文壇)
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[求助]
RCA滾環(huán)擴(kuò)增中用到的酶的問(wèn)題 已有1人參與
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| 我看到都是用phi29這種酶來(lái)做滾還擴(kuò)增，用KF聚合酶可以做嗎，以及這兩種酶之間有什么區(qū)別？有做過(guò)的前輩可以分享一下嗎。 |
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請(qǐng)問(wèn)，RCA產(chǎn)物跑0.5%的瓊脂糖，都留在孔道中，還有長(zhǎng)長(zhǎng)的拖尾，這是為什么 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2020-10-12 20:12:27
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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除了一般的DNA聚合外，RCA最大的特點(diǎn)是需要聚合酶持續(xù)的把之前生成的雙開“頂開”，也就是說(shuō)需要具有strand displacement性能。根據(jù)NEB官網(wǎng)信息，KF是Moderate strand displacement activity，感覺(jué)應(yīng)該可以做RCA但是可能效率會(huì)有影響。與之相對(duì)，phi29是strong strand displacement activity。 做RCA用的酶，除了strand displacement性能之外還會(huì)考慮exonuclease activity性能，是否具備這一性能對(duì)于RCA的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)有影響。KF不具備外切酶活性（以NEB官網(wǎng)說(shuō)明為準(zhǔn)，來(lái)源不同話可能性能有所不同）那么對(duì)primer的處理就需要保證其3'端是結(jié)核在circular tempalte上，通常的做法是用外切酶trim一下，這也要看你的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)咯。 此外，phi29的一個(gè)很大的問(wèn)題是其最適溫度是30°，所以反應(yīng)速度會(huì)慢一些。如果你是處于提高反應(yīng)溫度考慮而換酶的話，推薦你使用EquiPhi29，是phi29的熱穩(wěn)定版。 |
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炸魚條yy2樓2019-10-08 20:48:04
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3樓2019-10-09 09:08:34
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4樓2019-10-09 14:53:14
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