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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 蛋白/酶 » 293T細胞蛋白胞內表達
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由南往北木蟲 (正式寫手)
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[交流]
293T細胞蛋白胞內表達 已有4人參與
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大家好， 我是剛剛接觸真核表達的小白一枚，由專業(yè)公司合成了一個真核表達質粒，使用ptt5載體，打算使用293T細胞進行表達。目的基因在NCBI上檢索發(fā)現(xiàn)序列自身不帶有信號肽，于是額外添加了一個適合在293T細胞分泌表達的信號肽；但是合成后的質粒并不能分泌表達，在胞內具有一定的表達量，所以當時合成公司認定此質粒不能用于真核表達，為失敗�！驹摰鞍自吮磉_位包涵體，表達量lve低，但活性較好】 但是本人比較不信，于是收到“失敗”的質粒后，我使用lipofectamine2000/3000分別進行了293T轉染，使用雙抗夾心ELISA檢測發(fā)現(xiàn)細胞上清中有微量表達，大概40ug/L，胞內表達量相對較高，根據(jù)天然樣本的檢測推斷可能有40ug/10^5細胞（一個10cm平皿）。包涵體純化后蛋白質活性較原核表達低至少8倍。 那么，問題來了： 1、為什么合成公司認定胞內表達即為失��； 2、據(jù)我所了解的，基因信號肽主要作用是細胞內定位，那么沒有信號肽說明該蛋白沒有固定的表達位點？還是說它本身就是屬于包涵體，不可作為分泌表達？ 3、額外添加了信號肽為什么不能使其分泌表達？ 4、真核胞內表達的蛋白純化出來，經(jīng)過復性也會嚴重損失活性嗎？還是說胞內表達就已經(jīng)開始喪失活性？ 蛋白是想用來做免疫原的！ 感謝各位的談論指點，望大家實驗科研順利！ |
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4樓2020-05-18 23:50:20
tiandizao
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2樓2020-05-15 15:37:15
由南往北
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謝謝你！那么，某一個蛋白在胞內表達也是可以的對吧，不能認為胞內表達就不可以（按我的理解，合成公司的意思是任何蛋白必須是分泌型，不存在包涵體） 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2020-05-15 18:32:26
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5樓2020-05-19 08:00:51
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