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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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Western blot結(jié)果常見問題分析 已有2人參與
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蛋白免疫印跡(western blot即WB),想必做蛋白相關(guān)實驗的小伙伴們都很熟悉,這里就不過多贅述了,但是做起實驗并沒那么容易。每當(dāng)我們準(zhǔn)備好樣本,滿懷希望自己可以做出這樣的實驗結(jié)果時 面對這些殘忍的現(xiàn)實時,我們該怎么抉擇?重復(fù)一次?換個蛋白?換個抗體?顯然這些方案都不是更佳的方案。 為了避免出現(xiàn)以上問題 現(xiàn)在就給大家梳理一下western blot中常見問題以及對應(yīng)的解決方案。 1、條帶形狀不好看怎么回事? 可能的原因有: 1.凝膠的不均勻或聚合不好,應(yīng)對策略---灌膠前將溶液充分混勻。 2.樣本卦濃度較高.應(yīng)對策略_--樣本進(jìn)行除卦或者將樣本卦濃度調(diào)成一一致 3..緩沖液多次使用,導(dǎo)致成分發(fā)生變化,應(yīng)對策略---重新配制。 4.凝膠下部有氣泡.應(yīng)對策略---電泳前先趕走氣泡。 5.電泳時溫度過高應(yīng)對策略---降低電流或電壓。 2、沒有條帶是怎么回事? 可能的原因有: 1.二抗的HRP活性太強(qiáng)將底物消耗光,應(yīng)對策略---降低二抗的濃度。 2.ECL底物中H2O2不穩(wěn)定.失活.應(yīng)對策略_--更換ECL。 3. ECL底物沒有覆蓋到相應(yīng)的位置,應(yīng)對策略---重新洗膜之后再次曝光。 4.一抗使用不當(dāng)或者二抗失效應(yīng)對策略---在有效期內(nèi)使用抗體,并對應(yīng)來源。 3、背景高咋回事呢? 可能原因有： 1.洗膜不充分,應(yīng)對策略---建議增加洗液體積和洗滌次數(shù)。 2.電封閉不徹底應(yīng)對策略---提高封閉液的濃度,孵育時間,保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜封閉物使用不當(dāng)比如檢測生物素標(biāo)記的蛋白時不可以用脫脂奶粉,應(yīng)對策略---針對不同的蛋白使用不同的封閉物。 3.抗體非特異性結(jié)合,應(yīng)對策略---可以降低抗體的濃度或者減少孵育的時間。 |
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3樓2021-11-02 19:58:53
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2樓2021-11-01 10:04:16
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