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[求助]
TEV酶切mbp標簽蛋白，切不開
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如題，蛋白變性復性以后依然切不開 @gyesang 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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3樓2020-08-21 13:30:38
zsygxh
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1 首先確認一下TEV的酶切位點有沒有突變或其它問題 2 確認一下是真的復性成功了還是只是形成了可溶性聚集體或其它非正確構(gòu)象的狀態(tài)？有測活性嗎？有活性的話，有跑HPLC看一下是否是一個均一峰嗎？ 3 確認一下酶切溶液是否合適 4 以上都沒問題的話，可能是你的蛋白折疊后影響了酶切序列的暴露，由于存在空間位阻，TEV不能識別。可以查查這個蛋白的結(jié)構(gòu)有沒有人解出來，有的話可以看看N端的空間結(jié)構(gòu)。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2020-08-20 14:35:18
zsygxh
金蟲 (小有名氣)
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商業(yè)化的酶，按說明書的條件切的，默認酶切體系沒問題，沒切出來，那么大概率是你的蛋白的問題了。TEV識別的位點是ENLYFQG，切在Q-G之間。幾種可能性： 1. 載體上TEV識別的酶切序列發(fā)生突變，導致不能識別。建議：測序驗證一下； 2. TEV酶切位點序列正確，但是存在空間位阻，分兩種情況： 2.1 蛋白結(jié)構(gòu)正確：酶切位點前面的MBP標簽和后面連的目的蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響了酶切位點的暴露，使TEV無法接觸識別。建議：可以嘗試在酶切位點與標簽之間添加Linker，拉長位點與MBP的距離。 2.2 最大的可能性，蛋白沒有復性成功，碰到好多人都誤以為蛋白從沉淀轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄匀芤籂顟B(tài)就是復性成功了，實際上復性遠沒那么簡單。可溶性狀態(tài)可以是可溶性聚集體，也可以是多種不同構(gòu)象的混合物，實現(xiàn)這種轉(zhuǎn)變太簡單了，但要將其結(jié)構(gòu)歸一成完全正確的構(gòu)象那才是最困難的，所以懷疑你的蛋白沒有折疊成功，而結(jié)構(gòu)不對又影響了酶切位點的暴露，導致切不開。 |
4樓2020-08-21 17:02:55
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基因是讓別人合成的，反饋報告沒問題，中間也有了解linker.我是先在6M鹽酸胍中透析變性，再透析復性，全程沒有沉淀。我怎么知道我的蛋白復性成功沒？像我現(xiàn)在這樣，還有什么可以去嘗試的？謝謝 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2020-08-21 17:46:48
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