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曾在，天涯新蟲 (小有名氣)
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請教師兄師姐一個問題 已有3人參與
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各位師兄師姐，我目前在做重組蛋白的原核表達(dá)，有一個問題想請教各位，具體是這樣的： 我有兩個蛋白，給其中一個蛋白的C-融合了熒光蛋白GFP，而給另一個蛋白的C-融合了熒光蛋白C-mScarlet 我先將含有兩個融合蛋白的編碼序列分別整合到質(zhì)粒 pET28a和pET21a中。 隨后，我將兩個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21細(xì)胞中，37度過夜培養(yǎng)后有不少菌落我將它拿了出來，之后在室溫下放了一個周末。 今天我發(fā)現(xiàn)菌落長大了，仔細(xì)一看兩個平板上的菌落分別帶有淡淡的綠色和淡淡的粉色，于是我認(rèn)為我的目的蛋白應(yīng)該能很好表達(dá)，便非常高興�？墒俏肄D(zhuǎn)眼一想又有些困惑，不是說加了IPTG才能誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)嗎？可是平板上是肯定沒有加IPTG的。說能告訴我這是為什么？非常感謝！ |
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2樓2020-04-28 10:29:53
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先了解IPTG的誘導(dǎo)原理，我們再分析你這個實(shí)驗的進(jìn)程發(fā)展 基礎(chǔ)知識解析: 1. IPTG：異丙基硫代半乳糖苷，誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝，十分穩(wěn)定 2. BL21是大腸桿菌中用于高效表達(dá)菌株，適合表達(dá)非毒性蛋白，可轉(zhuǎn)化含有噬菌體T7啟動子的表達(dá)載體，位于λ噬菌體DE3區(qū)的T7噬菌體RNA聚合酶整合于B21染色體上，RNA聚合酶表 達(dá)后可高效結(jié)合于T7promoter，促進(jìn)外源質(zhì)粒的表達(dá) 背景原理： 大腸桿菌乳糖操縱子基因含有I（阻遏基因）P（啟動子）O（操縱子），結(jié)構(gòu)基因lacZ、lacY、lacA，分別表達(dá)β半乳糖苷酶、通透酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶 正常情況下在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)，Lac阻遏物能與操縱基因O結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動。而當(dāng)有誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合后， 其蛋白構(gòu)象就發(fā)生變化，導(dǎo)致阻遏物從操縱基因O上解離下來，RNA聚合酶不再受阻礙，發(fā)生轉(zhuǎn)錄。 分析你的實(shí)驗： 原核誘導(dǎo)表達(dá)，GFP綠色熒光，mScarlet猩紅色，著兩種標(biāo)記光色，少量需激發(fā)光下可查看，大量積累才可肉眼觀察到 按照理論分析是不會有目的蛋白產(chǎn)物累計，實(shí)際上會有一部分 建議： 在培養(yǎng)0小時收取，24h、48h、72h.。。。。。持續(xù)收獲5-7天，跑膠，考馬斯亮藍(lán)著色，查看目的位置的蛋白積累量變化 同時做IPTG，誘導(dǎo)，重復(fù)上述步驟，兩兩對比即可 |
3樓2020-04-28 10:30:31
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4樓2020-04-28 10:37:26
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5樓2020-04-28 10:45:15
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6樓2020-04-28 10:45:44
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7樓2020-04-28 11:31:06
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8樓2020-04-28 13:28:24
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9樓2020-07-09 23:56:24
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