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曾在，天涯新蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
請(qǐng)教師兄師姐一個(gè)問(wèn)題 已有3人參與
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各位師兄師姐，我目前在做重組蛋白的原核表達(dá)，有一個(gè)問(wèn)題想請(qǐng)教各位，具體是這樣的： 我有兩個(gè)蛋白，給其中一個(gè)蛋白的C-融合了熒光蛋白GFP，而給另一個(gè)蛋白的C-融合了熒光蛋白C-mScarlet 我先將含有兩個(gè)融合蛋白的編碼序列分別整合到質(zhì)粒 pET28a和pET21a中。 隨后，我將兩個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21細(xì)胞中，37度過(guò)夜培養(yǎng)后有不少菌落我將它拿了出來(lái)，之后在室溫下放了一個(gè)周末。 今天我發(fā)現(xiàn)菌落長(zhǎng)大了，仔細(xì)一看兩個(gè)平板上的菌落分別帶有淡淡的綠色和淡淡的粉色，于是我認(rèn)為我的目的蛋白應(yīng)該能很好表達(dá)，便非常高興�？墒俏肄D(zhuǎn)眼一想又有些困惑，不是說(shuō)加了IPTG才能誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)嗎？可是平板上是肯定沒(méi)有加IPTG的。說(shuō)能告訴我這是為什么？非常感謝！ |
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曾在，天涯
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5樓2020-04-28 10:45:15
ECUST_CAPF
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2樓2020-04-28 10:29:53
博士苑
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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先了解IPTG的誘導(dǎo)原理，我們?cè)俜治瞿氵@個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程發(fā)展 基礎(chǔ)知識(shí)解析: 1. IPTG：異丙基硫代半乳糖苷，誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝，十分穩(wěn)定 2. BL21是大腸桿菌中用于高效表達(dá)菌株，適合表達(dá)非毒性蛋白，可轉(zhuǎn)化含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體，位于λ噬菌體DE3區(qū)的T7噬菌體RNA聚合酶整合于B21染色體上，RNA聚合酶表 達(dá)后可高效結(jié)合于T7promoter，促進(jìn)外源質(zhì)粒的表達(dá) 背景原理： 大腸桿菌乳糖操縱子基因含有I（阻遏基因）P（啟動(dòng)子）O（操縱子），結(jié)構(gòu)基因lacZ、lacY、lacA，分別表達(dá)β半乳糖苷酶、通透酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶 正常情況下在沒(méi)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)，Lac阻遏物能與操縱基因O結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動(dòng)。而當(dāng)有誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合后， 其蛋白構(gòu)象就發(fā)生變化，導(dǎo)致阻遏物從操縱基因O上解離下來(lái)，RNA聚合酶不再受阻礙，發(fā)生轉(zhuǎn)錄。 分析你的實(shí)驗(yàn)： 原核誘導(dǎo)表達(dá)，GFP綠色熒光，mScarlet猩紅色，著兩種標(biāo)記光色，少量需激發(fā)光下可查看，大量積累才可肉眼觀察到 按照理論分析是不會(huì)有目的蛋白產(chǎn)物累計(jì)，實(shí)際上會(huì)有一部分 建議： 在培養(yǎng)0小時(shí)收取，24h、48h、72h.。。。。。持續(xù)收獲5-7天，跑膠，考馬斯亮藍(lán)著色，查看目的位置的蛋白積累量變化 同時(shí)做IPTG，誘導(dǎo)，重復(fù)上述步驟，兩兩對(duì)比即可 |
3樓2020-04-28 10:30:31
ECUST_CAPF
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4樓2020-04-28 10:37:26
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