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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
GST pulldown 實驗步驟及結果解讀～
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一、實驗前準備與樣品制備 1.試劑與材料 緩沖液： 裂解緩沖液：50mMTris-HCI（pH8.0），150mMNaC1,1%NP-40（或 TritonX-100），可用并添加新鮮的蛋白酶抑制劑（如 PMSF，Cocktail）和磷酸酶抑制劑（如研究磷酸化相關）洗滌緩沖液：同上但不加蛋白酶抑制劑；為降低背景，可提高鹽濃度（如500mMNaCl）或加入 0.1%SDS 洗脫緩沖液：50mMTris-HCI（pH8.0）.20mM 還原型谷胱甘肽；或直接使用2xSDS-PAGE 上樣緩沖液。 珠子：谷胱甘肽瓊脂糖珠或磁珠。 蛋白樣品： 誘餌蛋白：純化的GST-A（實驗組）和純化的GST蛋白（陰性對照組）。 獵物蛋白：含有目標互作蛋白的細胞裂解液或純化蛋白 His-B 2.誘餌蛋白準備 表達并純化 GST-目標蛋白和空 GST 標簽蛋白（對照用），分裝凍存于-80°C。 3.細胞裂解液制備 培養(yǎng)并收集一個10com圓皿細胞，預冷PBS洗滌細胞兩次；加入500L預冷的裂解緩沖液，冰上孵育15-30分鐘；用細胞刮刮下細胞，轉(zhuǎn)移至預冷的離心管；4°C，14000g 離心10分鐘小心吸取上清（即總蛋白裂解液），測定濃度，分裝備用二、Pull-down 核心步驟 4.平衡珠子 輕輕重懸谷胱甘肽珠子，吸取50wL 珠子懸液到1.5mL 離心管中，用1mL 預冷的裂解緩沖液洗滌珠子3次（離心：4°C,500-1000g,1-2min），去除儲存液中的乙醇。 5.偶聯(lián)誘餌蛋白（固定化） 取10ug純化的GST-目標蛋白和 GST蛋白分別與平衡好的珠子混合；在4°C旋轉(zhuǎn)搖床上孵育1-2小時，使GST與珠子充分結合；離心棄上清，用裂解緩沖液洗滌珠子3次，去除未結合的蛋白；此時，誘餌蛋白己固定在珠子上 6.孵育結合（“釣魚”過程） 將預清除后的細胞裂解液等量（1mg 蛋白量）加入已偶聯(lián)了GST-目標蛋白和GST 蛋白的兩份珠子中。在4°C旋轉(zhuǎn)搖床上孵育2-4小時或過夜。若獵物蛋白為純化蛋白，則在此步加入10ug純化的 His-B 蛋白 三、洗滌、洗脫與檢測 7.洗滌 離心，小心吸棄上清；用預冷的洗滌緩沖液重懸珠子，旋轉(zhuǎn)孵育3-5分鐘；離心，棄上清； 重復此步驟3-5次。第一次洗滌可溫和，后續(xù)洗滌可逐漸提高鹽濃度或加入低濃度去垢劑以去除非特異結合。 8.洗脫與樣品制備 吸盡最后一次洗滌液，直接加入20-40uL 1×或 2×SDS-PAGE 上樣緩沖液，渦旋混勻后95-100°C煮沸5-10min（膜蛋白室溫變性30min），使蛋白從珠子上變性脫落。 9.檢測 將樣品進行 SDS-PAGE 電泳； 陽性結果：在“GST-目標蛋白”組中能檢測到獵物蛋白條帶，而在“GST 空標簽”對照組中檢測不到或信號極弱。 四、注意事項 蛋白純化的注意事項 所有操作必須圍繞保持蛋白天然構象和生物活性展開。 一、實驗設計階段 表達系統(tǒng)匹配: 大腸桿菌:快速、經(jīng)濟，但無真核修飾，易形成包涵體。 真核系統(tǒng):可獲得正確折疊和修飾的蛋白，但周期長、成本高。 選擇依據(jù):下游應用決定。如Pull-down驗證可用原核表達:藥物靶點研究需真核表達。 標簽策略: GST標簽:增加可溶性，但可能干擾蛋白功能，純化后建議切除。 His標簽:分子量小，對結構干擾小。 二、操作過程關鍵點 全程低溫:4°C環(huán)境操作，緩沖液預冷。 抑制蛋白酶:必須添加新鮮的蛋白酶抑制劑混合物 避免氧化與聚集:添加I-10mM DTT或TCEP(注意  TT會破壞瓊脂糖珠，結合前需去除)。 對疏水蛋白，添加0.01%-0.1%非離子去垢劑(如Tween-20)。 徹底去除核酸:細菌裂解液中加入Benzonase核酸酶，減少非特異性結合。 溫和洗脫:采用梯度洗脫而非一步洗脫。 收集洗脫峰后立即置于冰上，并快速置換緩沖液(脫鹽柱/透析)。 三、質(zhì)量控制與保存 必須做的質(zhì)檢: SDS-PAGE:驗證純度和分子量。 Western Blot:確認目標蛋白身份。 活性測定:最關鍵的一步!純化后立即用功能實驗驗證(如酶活、Pull-down結合實驗)。 分裝保存:小體積分裝，避免反復凍融。 五、實驗結果解讀 GSTpull-down實驗 GSTpull-down的原理是利用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與谷胱甘肽(GSH)之間的高親和力，將GST融合蛋白固定在谷胱甘肽包被的瓊脂糖珠上，作為“誘餌”，用于捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”。此方法常用于體外檢測蛋白相互作用 兩種Pull-down實驗的區(qū)別 |
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