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靈思生物金蟲 (正式寫手)
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[交流]
單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的樣品選擇與準備
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確認測序類型：scRNA-seq還是snRNA-seq scRNA-seq（單細胞轉(zhuǎn)錄組測序）：側(cè)重于完整細胞的轉(zhuǎn)錄組分析，適用于研究細胞異質(zhì)性、細胞狀態(tài)和動態(tài)變化。 snRNA-seq（單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序）：適合于處理難以分離的組織或細胞，尤其是在腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)等復(fù)雜樣本中，專注于細胞核水平的基因表達研究。 1、根據(jù)樣本狀態(tài)：鮮活組織→scRNA-seq/snRNA-seq 冷凍組織→snRNA-seq 2、根據(jù)研究目標細胞特征： 重點關(guān)注免疫細胞→scRNA-seq 細胞直徑大于40um或異形細胞→snRNA-seq 保證能獲得高質(zhì)量細胞懸浮液 樣本需保持新鮮，建議組織樣本采樣后48小時內(nèi)、血液樣本采樣后24小時內(nèi)進行實驗操作。 樣本處理方法 細胞樣本 1、細胞要求建議送樣細胞總量≥5×105 cells，活率≥85%，細胞直徑為7~30μm。 2、采集與運輸懸浮細胞直接吹打混勻，貼壁細胞用0.25% Trypsin-EDTA消化。運輸時將細胞懸液保持在2-8℃，2小時內(nèi)完成后續(xù)處理。如需凍存運輸，可將106~107個細胞重懸于1mL凍存液中，-80℃冷凍保存后移至液氮中，3個月內(nèi)復(fù)蘇。 體液樣本 1、樣本采集血液樣本≥4mL，使用EDTA抗凝管（紫蓋）。晨尿≥100mL，收集于無菌容器中。 2、保存與運輸血液樣本：EDTA抗凝采血管收集，采樣后及時顛倒混勻，取樣后4℃運輸，8h內(nèi)運送至實驗室。如需長途運輸，建議采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC細胞，并進行凍存后寄送。尿液：取樣后加入5-10%體積比加入細胞保護劑，4℃保存，4h運輸至實驗室。 新鮮組織樣本 1、樣本采集新鮮組織：樣本量≥200mg（至少黃豆大�。�。穿刺組織：≥2條（長度1.5cm，直徑≥1.5mm）。 2、保存及運輸新鮮組織樣本要求全部浸沒于預(yù)冷的2ml組織保存液離心管中4℃保存，推薦Miltenyi 組織保存液（貨號130-100-008），離體48h內(nèi)冰袋運輸至實驗室。 3、注意事項實驗組與對照組樣本的采集狀態(tài)盡量保持一致；組織較大時，可分割為多顆粒進行保存運輸，盡量剔除非目標組織，如多余脂肪、包膜；清洗去除血液殘留；手術(shù)刀切取，盡量避免化學(xué)試劑污染及激光刀、電刀熱損傷。 凍存組織樣本 1、樣本采集凍存組織樣本保存時間最好是半年內(nèi)。 2、保存及運輸凍存組織樣本可用干冰運輸至公司實驗室，保證干冰充足，確保樣本到達時仍處于凍存的環(huán)境。實驗室抽提細胞核進行后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序分析。 建議：1、肝實質(zhì)細胞或成熟脂肪細胞細胞較大且容易破裂，肌肉、心臟、腦、神經(jīng)等組織細胞直徑過大超過40μm的，以及冷凍樣本，建議選用抽核的方式進行單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序。其他樣本則優(yōu)先選擇做單細胞轉(zhuǎn)錄組。 2、胰腺、小鼠腸道等自身容易降解的樣本，需注意避免過度清洗，且盡量不要長途運輸，盡快消化上機。 3、運輸注意保存環(huán)境，避免樣本降解，可提前聯(lián)系實驗室提供樣品寄送服務(wù)與指導(dǎo)。 |
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