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靈思生物金蟲 (正式寫手)
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[交流]
單細胞微生物轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，打開微生物功能研究的新視界
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在過去的幾年中，單細胞RNA-seq (scRNA-seq)在人和小鼠細胞中廣泛應(yīng)用并取得重大進展。然而，微生物學的絕大多數(shù)研究仍然依賴于平均數(shù)千甚至數(shù)百萬個細菌的批量測量，主要關(guān)注整個微生物群體的平均行為，忽略了單個微生物細胞之間的差異。單細胞微生物轉(zhuǎn)錄組技術(shù)是一種在單個微生物細胞水平上檢測基因表達。通過分離單個微生物細胞，提取并擴增其RNA，結(jié)合高通量測序技術(shù)，能夠全面分析每個細胞的轉(zhuǎn)錄組信息，從而揭示了微生物個體之間的功能和表達差異。為探索微生物的生理狀態(tài)、代謝途徑及細胞間相互作用提供了有力工具。 應(yīng)用場景 1.細菌耐藥性研究： 通過分析單個細菌細胞的轉(zhuǎn)錄組水平，識別出與耐藥性相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路，如抗生素降解酶、外排泵和細胞壁修飾相關(guān)基因的表達變化。此外，可通過對耐藥菌進行聚類分群分析，識別出具有高耐藥潛力的細胞亞群，為理解耐藥性的產(chǎn)生和傳播機制提供新的視角。 2.環(huán)境壓力下細菌進化研究： 重金屬和消毒劑等環(huán)境壓力會對細菌造成嚴重的生理脅迫，而細菌通過進化適應(yīng)機制發(fā)展出多種生存策略。單細胞微生物轉(zhuǎn)錄組技術(shù)能夠在單個微生物水平上揭示這些策略的分子基礎(chǔ)，為理解細菌的環(huán)境適應(yīng)性和進化機制提供實驗數(shù)據(jù)支持。 3.病原菌研究： （1）通過對單個微生物轉(zhuǎn)錄水平分析，可以揭示病原菌在感染過程中不同亞群的基因表達異質(zhì)性，識別出與宿主定植、免疫逃逸和毒力相關(guān)的關(guān)鍵基因。(2)分析患者體內(nèi)病原菌的單個微生物轉(zhuǎn)錄組，識別出耐藥基因的表達模式、激活狀態(tài)以及細菌亞群的分布特征，為臨床治療提供針對性方案。 4.工業(yè)菌研究： （1）探究益生菌功能因子表達機制，揭示不同亞群在功能表達上的異質(zhì)性，從而深入理解益生菌的生理狀態(tài)和功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。（2）明晰釀酒工程菌株風味形成原理，闡明不同微生物亞群對風味物質(zhì)合成的貢獻。 5.噬菌體相關(guān)研究： 研究噬菌體-細菌互作，揭示細菌在噬菌體感染過程中的基因表達變化，識別出與噬菌體吸附、復(fù)制和裂解相關(guān)的關(guān)鍵基因，輔助噬菌體療法療效評價。 靈思技術(shù)平臺優(yōu)勢 1.穩(wěn)定可靠多通道高通量；重復(fù)性好，批間差小，數(shù)據(jù)有保證 2.性能優(yōu)越細菌多包率＜5%；細菌捕獲率可達50%；有效細菌數(shù)＞2000 3.系統(tǒng)全面單個細菌檢測基因數(shù)中位數(shù)＞100 4.配套完善特配生信軟件，數(shù)據(jù)分析高效深入；試劑盒組分完整 靈思技術(shù)平臺流程 1.細菌單細胞懸液制備：搖菌至對數(shù)生長期（無生長時期要求的樣本），測量OD600值。 2.細菌固定和透化：利用4%的固定液4℃旋轉(zhuǎn)過夜固定細菌，讓RNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)，停止基因表達并減少RNA降解。利用細胞裂解液裂解細胞壁并用細胞透膜劑對細菌細胞膜進行通透化處理，便于后續(xù)試劑進入胞內(nèi)進行反應(yīng)。 3.細菌原位逆轉(zhuǎn)錄：細菌細胞內(nèi)進行逆轉(zhuǎn)錄，mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到一鏈cDNA。 4.細菌內(nèi)cDNA 3加A尾：利用酶接法在一鏈cDNA的3端加上poly A結(jié)構(gòu)，便于后續(xù)進行mRNA捕獲。 5.液滴生成及液滴內(nèi)反應(yīng)：液滴包裹單個細菌和單個微球，在液滴內(nèi)進行cDNA二鏈合成，同時利用微球上的分子標簽對cDNA進行標記。 6.破乳、cDNA富集和建庫測序：打破液滴，收集cDNA，利用磁珠將富集后的DNA純化，通過PCR擴增純化后DNA兩端添加測序引物及index，同時進行DNA富集。利用PE150對文庫進行測序。 靈思技術(shù)平臺數(shù)據(jù)分析流程 數(shù)據(jù)分析是從原始測序數(shù)據(jù)提取生物學信息的關(guān)鍵步驟。這一環(huán)節(jié)包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、細胞聚類與注釋、差異基因表達分析等步驟，同時靈思生物也可進行病毒&質(zhì)粒分析、耐藥&毒力基因分析、擬時序分析等。目的是揭示細胞間的生物群體中的基因表達異質(zhì)性和功能多樣性，為深入理解微生物的生理狀態(tài)、代謝途徑及細胞間相互作用提供關(guān)鍵見解。 |
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