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科研戰(zhàn)神來(lái)了新蟲 (小有名氣)
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一文分清5種互作實(shí)驗(yàn)：IP/CoIP/Pull down/RIP/ChIP，再也不混淆！
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在分子生物學(xué)研究中，“找互作”是解析機(jī)制的關(guān)鍵步驟——比如想知道蛋白A和蛋白B是否結(jié)合、蛋白C是否調(diào)控基因D的表達(dá)，都需要靠特定的互作實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。但很多科研人剛?cè)腴T時(shí)，都會(huì)被IP、CoIP、Pull down、RIP、ChIP這些實(shí)驗(yàn)繞暈，它們雖然名字長(zhǎng)得像，但是定義和應(yīng)用各不相同，今天主要來(lái)理清這幾種互作實(shí)驗(yàn)的原理及應(yīng)用。 01 IP實(shí)驗(yàn)原理：IP技術(shù)的核心原理是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的情況下，按適當(dāng)比例形成可見的免疫復(fù)合物。這些復(fù)合物可以通過(guò)Protein A或Protein G固定在磁珠或瓊脂糖凝膠珠上，從而從混合物中沉淀下來(lái)。通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的雜蛋白后，目標(biāo)蛋白可以從磁珠上洗脫下來(lái)，進(jìn)行后續(xù)分析。形象一點(diǎn)描述就是把細(xì)胞裂解液想象成擠滿人的大舞廳，先派只認(rèn)目標(biāo)蛋白的 “專屬特工”（抗體）進(jìn)去，它一眼鎖定目標(biāo)并死死貼��；再扔進(jìn)只抓帶特工標(biāo)記的 “抓捕網(wǎng)兜”（磁珠），一兜就把 “特工 + 目標(biāo)” 一起撈起；接著用力抖掉網(wǎng)兜上的路人雜蛋白，最后用洗脫液讓特工松手，干凈的目標(biāo)蛋白就被單獨(dú)拿了出來(lái)。研究目的：① 驗(yàn)證細(xì)胞中是否表達(dá)目標(biāo)蛋白；② 富集目標(biāo)蛋白，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如質(zhì)譜鑒定互作蛋白）做準(zhǔn)備。關(guān)鍵特點(diǎn)：只針對(duì)“單一蛋白”，不直接驗(yàn)證蛋白-蛋白互作（但如果后續(xù)對(duì)沉淀下來(lái)的復(fù)合物做質(zhì)譜，能篩選潛在的互作蛋白）。 02 CoIP原理：CoIP是體內(nèi)驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白是否發(fā)生相互作用的金標(biāo)準(zhǔn)，是基于IP實(shí)驗(yàn)的延伸——用針對(duì)“蛋白A”的抗體沉淀蛋白A時(shí)，如果蛋白A和蛋白B在細(xì)胞內(nèi)天然結(jié)合形成復(fù)合物，那么蛋白B會(huì)被一起沉淀下來(lái)，最后用WB檢測(cè)蛋白B即可驗(yàn)證A蛋白和B蛋白是否發(fā)生相互作用研究目的：驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白在細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下是否存在互作。關(guān)鍵特點(diǎn)：① 基于細(xì)胞內(nèi)天然復(fù)合物，真實(shí)性高；② 只能驗(yàn)證“已知蛋白”的互作（無(wú)法篩選未知互作蛋白）；③ 可能存在“間接互作”（比如A和C結(jié)合，C和B結(jié)合，CoIP可能同時(shí)沉淀A、B、C，誤以為A和B直接結(jié)合）。 03 Pull down原理：Pulldown實(shí)驗(yàn)的核心是親和捕獲。首先將已知的 “誘餌” 分子（蛋白或核酸）固定在固相載體（如瓊脂糖珠、磁珠）上，再與含有潛在互作 “獵物” 分子的樣品共同孵育。在適宜條件下，能與 “誘餌” 特異性結(jié)合的 “獵物” 會(huì)被載體捕獲，未結(jié)合的雜質(zhì)則通過(guò)洗滌去除。最后洗脫結(jié)合的復(fù)合物，即可通過(guò) WB、質(zhì)譜等技術(shù)鑒定 “獵物” 的身份與互作關(guān)系。是體外驗(yàn)證“兩個(gè)蛋白或者蛋白與核酸是否直接互作”的金標(biāo)準(zhǔn)研究目的：驗(yàn)證兩個(gè)蛋白是否“直接結(jié)合”（排除間接互作的干擾）；或從細(xì)胞裂解液中篩選能與蛋白A結(jié)合的“未知蛋白”。關(guān)鍵特點(diǎn)：① 體外實(shí)驗(yàn)，環(huán)境可控，可驗(yàn)證直接互作；② 可用于篩選未知互作蛋白（搭配質(zhì)譜）。 04 RIP原理：RIP實(shí)驗(yàn)的原理與IP類似，但是其主要目標(biāo)是捕獲與特定蛋白結(jié)合的RNA分子。通過(guò)使用針對(duì)“RNA結(jié)合蛋白（RBP）”的特異性抗體，從細(xì)胞裂解液中沉淀該蛋白；由于蛋白和RNA在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合形成復(fù)合物，沉淀下來(lái)的復(fù)合物中會(huì)包含結(jié)合的RNA；最后用RT-PCR、qPCR或測(cè)序（RIP-seq）鑒定這些RNA的身份。研究目的：① 驗(yàn)證某一已知RNA是否與目標(biāo)RBP結(jié)合；② 篩選目標(biāo)RBP在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的RNA（RIP-seq，高通量篩選）。關(guān)鍵特點(diǎn)：基于細(xì)胞內(nèi)天然的蛋白-RNA復(fù)合物，貼近生理狀態(tài)；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需注意RNA酶的抑制（避免RNA降解）。 05 ChIP如果想研究“轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白等蛋白是否結(jié)合特定DNA序列”（比如轉(zhuǎn)錄因子是否結(jié)合基因的啟動(dòng)子區(qū)域），就需要用ChIP實(shí)驗(yàn)。原理：ChIP 是研究體內(nèi)蛋白與染色質(zhì) DNA 互作的核心技術(shù)。其通過(guò)甲醛交聯(lián)固定細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)發(fā)生的蛋白 - DNA 復(fù)合物，將染色質(zhì)超聲或酶切為 200–500 bp 的片段；再利用目標(biāo)蛋白的特異性抗體免疫沉淀復(fù)合物；經(jīng)解交聯(lián)釋放 DNA 后，通過(guò) ChIP-qPCR 驗(yàn)證特定位點(diǎn)的結(jié)合，或通過(guò) ChIP-seq 進(jìn)行全基因組結(jié)合位點(diǎn)的高通量篩選。研究目的：① 驗(yàn)證某一已知DNA序列（如基因啟動(dòng)子）是否與目標(biāo)蛋白結(jié)合；② 篩選目標(biāo)蛋白在全基因組上結(jié)合的所有DNA位點(diǎn)（ChIP-seq，高通量篩選）。關(guān)鍵特點(diǎn)：研究的是“蛋白與染色質(zhì)DNA”的互作（而非游離DNA），能真實(shí)反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控狀態(tài)。 |
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