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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
關于WB實驗，你需要知道的蛋白提取步驟
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| 蛋白提取是WN實驗中重要的一步，今天分享蛋白提取步驟：【貼壁細胞，以6孔板為例】1.棄去細胞培養(yǎng)瓶或者細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入預冷的PBS（去除血清及死細胞等），輕輕地搖晃洗滌，然后去除 PBS。 (注意：整個過程在冰上操作)2.加入PBS，利用細胞刮，也可以使用滅菌槍頭，來回刮取細胞，小心吸取并轉移至一個空的EP管內。1500 rpm離心5分鐘，去除上清。3.加入100-200 μL 預冷的細胞裂解液（磷酸酶抑制劑：蛋白酶抑制劑：裂解液=1：1：100），(Tip: 如果蛋白濃度不高，可以適當增加蛋白酶抑制劑的濃度).4.冰上裂解30 min后，4℃ 12,000 rpm下離心20min。5.小心吸取上清液至一個新的EP管內，于 -20℃或 -80℃保存待用。【懸浮細胞】1.從細胞培養(yǎng)瓶或者細胞培養(yǎng)板中小心吸取細胞至離心管內，1500 rpm 離心10分鐘，去除上清。2.加入預冷的PBS，小心吹打均勻，1500 rpm 離心5分鐘，去除上清。3.用濾紙吸干殘余的PBS，加入100-200 μL 預冷的細胞裂解液，。冰上靜置30 min, 隨后，4℃ 12,000 rpm下離心20 min。4.小心吸取上清液至一個新的EP管內，記錄吸取量，于 -20℃或 -80℃保存待用�！緞游锝M織】1.從-80℃取出樣本，插入冰中，電子天平稱量~30-50mg2.將組織放入2mL離心管中，且離心管中放入2-3個小研磨珠。加入300μL裂解液3.使用組織勻漿器（設置研磨參數(shù)：60HZ 運行15S，停止30S，重復5次，具體可以根據(jù)不同組織設置）4.研磨后會產生大量的泡沫，此時可以放置於4℃冰箱靜置15-20min5.4℃ 12,000rpm離心20min,取上清置于新的離心管中，-80℃保存或-20℃保存待用。 |
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