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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
WB蛋白提取，裂解液該如何選？
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蛋白樣品的制備作為WB實驗的第一步，也是決定實驗成敗的關(guān)鍵。很多同學(xué)可能會認(rèn)為樣品制備很簡單，加點裂解液、煮一煮、上樣就完事，對這一步不夠重視。當(dāng) WB實驗失敗時，往往是優(yōu)先考慮調(diào)整操作條件，而忽略了最根本的源頭——蛋白樣品的質(zhì)量。但一次成功的 WB，七分靠樣品，三分靠操作。如果在起始步驟蛋白樣品就已經(jīng)降解或丟失，那后續(xù)無論怎么優(yōu)化條件，都難以獲得可靠的結(jié)果。今天這篇文章，我們就來盤點一下蛋白提取過程中，裂解液該如何選？ 首先我們來看看裂解液是如何發(fā)揮作用，讓樣品中的蛋白跑到溶液中的？一般來說，我們現(xiàn)在實驗室里用到的裂解液成分主要是：去垢劑+緩沖體系+鹽離子，去垢劑決定了裂解液的裂解能力，是整個裂解液中最核心的部分。 當(dāng)去垢劑濃度達(dá)到一定程度時，它們會競爭性地取代原本包裹在膜蛋白周邊的磷脂雙分子層。膜蛋白通常含有疏水的跨膜區(qū)，去垢劑的長尾巴會附著在蛋白的疏水區(qū)，保護(hù)其不被極性的水環(huán)境排斥。 膜蛋白完全被去垢劑分子包裹，形成了一個球形的“膠束”結(jié)構(gòu)。在這個膠束中，去垢劑的疏水尾部向內(nèi)緊貼蛋白，親水頭部向外接觸水環(huán)境。這樣，原本不溶于水的膜蛋白就變成了“水溶性”的，能夠穩(wěn)定地存在于裂解液的上清液中。 根據(jù)去垢劑的類型和裂解強度，我們通常將實驗用到的裂解液分為三類：溫和型（非變性）、中等強度型和強變性型。在操作之前我們需要停下來，花幾分鐘思考：“我的目標(biāo)蛋白是什么類型？它位于細(xì)胞哪個部位？是否帶有易丟失的修飾？”因為這幾個問題決定了我們裂解液的選擇。 溫和型（非變性）裂解液這類裂解液以 NP-40 或 Triton X-100 等非離子型去垢劑為主，能夠有效溶解細(xì)胞質(zhì)膜，充適合可溶性胞質(zhì)蛋白和膜結(jié)合蛋白，能最大程度保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象及蛋白–蛋白相互作用。但如果你的目的蛋白是像組蛋白、細(xì)胞骨架等難以從細(xì)胞中釋放的蛋白，那可能就需要選擇中等或強變性裂解液來提高蛋白提取率。 中等強度型裂解液中等強度裂解液，即“中度變性”或“部分變性”，以 RIPA為主。我們在實驗室中，最常用的也是RIPA裂解液，它能高效提取多種類型的蛋白，廣泛用于Western blot。市面上的RIPA裂解液配方有很多種，根據(jù)其裂解液的強度大致可以再細(xì)分為強、中、弱三類。強RIPA裂解液適用于難溶蛋白、核蛋白、膜蛋白；中等強度 RIPA 裂解液是我們最常用的，適合大多數(shù)常規(guī)的WB實驗，它能在保留部分蛋白天然構(gòu)象的同時，仍具有較強裂解能力；弱RIPA裂解液的作用接近于非變性裂解液，適用于蛋白互作研究及功能性蛋白復(fù)合物的分析 強變性型裂解液這一類裂解液以SDS為代表，它能夠完全變性蛋白，破壞所有高級結(jié)構(gòu)和相互作用，溶解能力極強，適用于提取難溶蛋白、包涵體以及高度疏水膜蛋白。使用這類裂解液的時候需要注意，由于強變性裂解液提取效率比較高，因此提取得到的蛋白樣品濃度往往也會高于前兩種條件，因此，在后續(xù)電泳上樣時要注意控制上樣量，避免因為過度上樣導(dǎo)致條帶拖尾、彌散。 |
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