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科研戰(zhàn)神來(lái)了新蟲(chóng) (小有名氣)
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ELISA、WB、IHC實(shí)驗(yàn)技術(shù)的 區(qū)別與選擇攻略
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ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）運(yùn)用免疫學(xué)原理與化學(xué)反應(yīng)顯色的方法，將抗原或者抗體固定在酶標(biāo)板的微孔中，再加入待檢測(cè)的樣本（通常是血清、血漿、組織或細(xì)胞培養(yǎng)上清等），樣本中的目標(biāo)蛋白會(huì)與載體上的分子特異性結(jié)合；再加入酶標(biāo)記的二抗，形成“抗原-抗體-酶標(biāo)記物”復(fù)合物；最后加入底物，酶會(huì)催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，進(jìn)而計(jì)算出目標(biāo)蛋白的濃度。ELISA實(shí)驗(yàn)全程在液體體系+固相載體中完成，無(wú)需復(fù)雜的分離、切片操作，可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。 WB實(shí)驗(yàn)（蛋白免疫印跡）WB實(shí)驗(yàn)是基于分子量分離蛋白以及膜上特異性檢測(cè)，當(dāng)我們制備好樣本后，首先需要利用SDS-PAGE電泳（按分子量分離蛋白），再使用電轉(zhuǎn)儀把已分離開(kāi)的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移至固相載體（NC膜或PVDF膜等），最后利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色的方式進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過(guò)曝光得到的條帶，判斷目標(biāo)蛋白是否存在，同時(shí)可通過(guò)條帶的位置驗(yàn)證蛋白分子量，通過(guò)條帶灰度半定量分析蛋白表達(dá)量。 WB實(shí)驗(yàn)（蛋白免疫印跡）免疫組化利用了免疫學(xué)原理與組織學(xué)技術(shù)，通過(guò)將新鮮組織或石蠟包埋組織制作成切片，經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)、封閉等處理后，在樣本中加入一抗，與組織中的目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，再加入熒光標(biāo)記的二抗或者酶標(biāo)記的二抗，再通過(guò)顯微鏡觀察，可以清晰的觀察到目標(biāo)蛋白在組織或細(xì)胞中的具體分布位置（如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等）。，加入一抗與組織中的目標(biāo)蛋白結(jié)合，再加入熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記的二抗，最后通過(guò)熒光顯微鏡或顯色反應(yīng)（如DAB顯色），觀察目標(biāo)蛋白在組織或細(xì)胞中的具體分布位置（如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等）。 總結(jié)：免疫組化能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白進(jìn)行精準(zhǔn)的定位，是定位研究的首選實(shí)驗(yàn)手段；WB實(shí)驗(yàn)的定量相較于IHC更精準(zhǔn)，即使我們可以通過(guò)提取細(xì)胞和蛋白，膜蛋白，胞漿蛋白來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的含量從而間接證明目標(biāo)蛋白的定位，但是其靈敏度遠(yuǎn)低于IHC實(shí)驗(yàn)；ELISA實(shí)驗(yàn)是三種實(shí)驗(yàn)手段中定量最準(zhǔn)確的，是檢測(cè)分泌蛋白的首選。 |
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