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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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微生物分離培養(yǎng)的三種方法
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在微生物科研領(lǐng)域，分離培養(yǎng)是關(guān)鍵技術(shù)。微生物在自然環(huán)境里多以混合群體形式存在，而科研常需針對(duì)特定微生物深入研究，此時(shí)分離培養(yǎng)技術(shù)就很重要。其原理是利用微生物的生理生化特性差異，從而把目標(biāo)微生物從混合群體中分離，常用的方法有劃線分離法、涂布平板法和傾注平板法。 方法一：平板劃線法 （一）原理剖析 平板劃線法是一種經(jīng)典的微生物分離技術(shù)，其原理很簡(jiǎn)單。它是用接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面劃線。把含有多種微生物的菌液用接種環(huán)蘸取后，在平板上劃線，菌液會(huì)在培養(yǎng)基表面鋪展。每次劃線后，接種環(huán)上的微生物細(xì)胞數(shù)量因分散而減少，相當(dāng)于稀釋了一次。劃線次數(shù)越多，微生物細(xì)胞越被稀釋，最后分散成單個(gè)細(xì)胞。在合適的條件下，單個(gè)細(xì)胞會(huì)生長(zhǎng)、繁殖，形成獨(dú)立的單菌落。每個(gè)單菌落都是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而來的，理論上遺傳物質(zhì)相同，是純種微生物。這樣，科研人員就能從混合微生物群體中分離出目標(biāo)微生物的純培養(yǎng)物。 （二）操作步驟詳解 取菌種：從存菌種的容器里把目標(biāo)菌種拿出來。要是菌種是冷凍保存的，得先在合適的地方讓它慢慢恢復(fù)活性，這樣才能方便后面的操作。比如說，從低溫冰箱里拿出用甘油管保存的菌種后，要把它放在 37℃的水浴鍋里快速解凍。 接種針滅菌冷卻：一般用鎳鉻合金絲做的接種環(huán)來當(dāng)接種針。拿這個(gè)接種環(huán)在酒精燈外焰上燒，一直燒到金屬絲發(fā)紅，這樣能確保把可能存在的雜菌都?xì)⑺�。滅完菌后，把接種環(huán)放一邊，讓它自己降降溫，別燙死了待會(huì)兒要接的微生物。 蘸取菌種：先用 75% 的酒精棉球擦擦手，等酒精完全揮發(fā)后，在酒精燈火焰無菌區(qū)，用已經(jīng)冷卻的接種環(huán)蘸點(diǎn)菌種。操作的時(shí)候得注意，別讓接種環(huán)碰到其他可能有污染的東西，得保證蘸的菌種是純的。 劃線：拿一個(gè)已經(jīng)做好的固體平板培養(yǎng)基。在燒接種環(huán)的時(shí)候，把平板靠近酒精燈火焰稍微消消毒，這樣能少沾點(diǎn)平板表面的雜菌。打開平板后，先把接種環(huán)上的菌種在平板一側(cè)連續(xù)劃 3 - 4 次線，先弄出一個(gè)初始的菌帶。接著一邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板一邊用酒精燈燒接種環(huán)，再次滅菌后等它冷卻，然后從起始菌帶末端開始，穿過之前劃的線繼續(xù)劃。劃幾次得看菌液濃度和菌種類型。要是菌液濃度高，可能得多劃幾次，好讓菌充分稀釋；對(duì)于長(zhǎng)得快、易分散的菌種，劃線次數(shù)也可以變一變。劃的時(shí)候，接種環(huán)要跟平板表面保持約 30° - 40° 角，力度均勻，別把培養(yǎng)基劃破。 標(biāo)記：在平板底部邊緣，用記號(hào)筆清楚地寫上菌種名稱、接種日期，還有其他相關(guān)信息，比如實(shí)驗(yàn)編號(hào)、操作人這些，這樣后面能方便識(shí)別和管理平板。 培養(yǎng)：劃好線的平板倒著放進(jìn)恒溫培養(yǎng)箱里，按目標(biāo)微生物適合的生長(zhǎng)溫度來培養(yǎng)。把平板倒著放，是為了防止培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的冷凝水滴到培養(yǎng)基表面，影響菌落生長(zhǎng)和形態(tài)，也能少點(diǎn)雜菌污染的可能。 保存：培養(yǎng)好了，要是暫時(shí)不用平板上的菌種，就把它放進(jìn) 4℃的冰箱里存著。保存的時(shí)候要注意把平板密封好，防止水分蒸發(fā)和雜菌污染。 （三）操作技巧與注意事項(xiàng) 接種環(huán)要燒一燒：每次劃線前后都要用酒精燈把接種環(huán)燒紅，這樣才能把上面殘留的微生物都滅掉。燒完后，得等接種環(huán)變涼了再接著操作，不然高溫會(huì)把菌種燙死，實(shí)驗(yàn)就白費(fèi)了。 操作得無菌：平板劃線整個(gè)過程要講究無菌，最好在超凈工作臺(tái)里弄。要是沒有超凈工作臺(tái)，就在酒精燈火焰旁邊操作，這樣能少沾點(diǎn)雜菌。操作的時(shí)候，手別亂碰平板里面和接種環(huán)前端接觸菌種、培養(yǎng)基的地方。 力度要適中：劃線的時(shí)候別太用力，不然會(huì)把培養(yǎng)基劃破。要是培養(yǎng)基破了，菌落長(zhǎng)不好，分布也不均勻，而且不同區(qū)域的微生物會(huì)混在一起，就達(dá)不到分離的效果了。 平板得挑挑處理處理：選平板培養(yǎng)基時(shí)，表面要干燥、硬度合適。要是平板上有水珠，微生物分布就不均勻，不利于單菌落形成。剛倒好的平板如果有冷凝水，可以倒置在 37℃培養(yǎng)箱里放一會(huì)兒，讓水分蒸發(fā)。 標(biāo)記要清楚：標(biāo)記信息一定要寫清楚、準(zhǔn)確，不然容易混。要是標(biāo)記模糊，后續(xù)實(shí)驗(yàn)里就分不清菌種和相關(guān)情況，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)行和結(jié)果分析。 方法二：涂布平板法 （一）技術(shù)原理 涂布平板法主要是根據(jù)微生物在合適環(huán)境里能生長(zhǎng)的特點(diǎn)來的。先要對(duì)要分離的微生物樣本做梯度稀釋，這么做就是想讓樣本里的菌體盡量分開，變成一個(gè)個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞。稀釋的次數(shù)越多，樣本里的微生物細(xì)胞就越來越稀。等稀釋到一定程度，原本聚在一起的微生物細(xì)胞就被分開了。接著把不同稀釋程度的菌液均勻地涂在固體培養(yǎng)基上，這樣每個(gè)單細(xì)胞在培養(yǎng)基上都有機(jī)會(huì)獨(dú)自生長(zhǎng)、繁殖。在合適的溫度、濕度等條件下養(yǎng)一段時(shí)間，這些單細(xì)胞就會(huì)不斷分裂繁殖，最后形成一個(gè)個(gè)能用肉眼看到的單菌落。因?yàn)槊總�(gè)單菌落都是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖出來的，所以從理論上講，每個(gè)菌落都代表了一個(gè)純的微生物菌株，這樣就能把微生物給分離出來了。而且還能通過數(shù)平板上的菌落數(shù)量，再結(jié)合稀釋的倍數(shù)和涂布時(shí)用的菌液體積，算出樣本里微生物的數(shù)量，所以涂布平板法既可以用來分離微生物，還能做定量分析，是比較實(shí)用的一種方法。 （二）梯度稀釋與涂布操作流程 稱量樣品和初步稀釋：稱 10g 待測(cè)樣品，比如土壤樣品，放到有 90ml 無菌水和小玻璃珠的 250ml 三角瓶中。小玻璃珠能在振蕩時(shí)讓微生物細(xì)胞分散得更好。把三角瓶放搖床上搖 20 分鐘，讓微生物細(xì)胞充分分散在無菌水里，這就得到了 10⁻¹ 稀釋液。搖完后，靜置 20 - 30 秒，讓大的顆粒沉下來。 繼續(xù)稀釋：用 1ml 無菌吸管取 1ml 10⁻¹ 稀釋液，放入有 9ml 無菌水的試管中，用吸管反復(fù)吹吸 3 次，混勻后得到 10⁻² 稀釋液。換支無菌吸管，取 1ml 10⁻² 稀釋液，放入有 9ml 無菌水的新試管，同樣吹吸 3 次，得到 10⁻³ 稀釋液。依此類推，得到不同稀釋度的菌液。每次換稀釋度都要換新吸管，防交叉污染。 標(biāo)記平板：準(zhǔn)備些無菌平板，在底部用記號(hào)筆寫上對(duì)應(yīng)稀釋度，比如 10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵ 等，也可以寫樣品名、實(shí)驗(yàn)日期等，方便后續(xù)識(shí)別和管理。 涂布菌液：用無菌吸管取 0.1ml 不同稀釋度的菌液，分別滴到對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基上。用無玻璃菌刮刀（涂布棒）涂勻。先在酒精燈上燒玻璃刮刀滅菌，冷卻后再涂布。從低濃度開始，涂完一個(gè)平板，再燒刮刀滅菌。涂的時(shí)候，刮刀和平板表面呈 30° - 40° 角，輕輕勻速涂開，別用力過猛劃破培養(yǎng)基。 培養(yǎng)：涂好菌液的平板倒著放恒溫培養(yǎng)箱里，按目標(biāo)微生物的生長(zhǎng)特性設(shè)合適溫度和時(shí)間。比如，多數(shù)細(xì)菌在 37℃培養(yǎng) 24 - 48 小時(shí)，真菌在 25℃左右培養(yǎng) 3 - 5 天。倒置平板能防止冷凝水滴落，影響菌落生長(zhǎng)和形態(tài)，還能減少雜菌污染。 計(jì)數(shù)和保存：培養(yǎng)結(jié)束后，取平板，選菌落數(shù)在 30 - 300 個(gè)的平板計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，記錄每個(gè)平板的數(shù)據(jù)。多個(gè)合格平板就算平均值。按公式 “每克樣品菌株數(shù) = （平板菌落數(shù) ÷ 涂布稀釋液體積）× 稀釋倍數(shù)” 算微生物數(shù)量。計(jì)數(shù)完，若要保存平板菌種，密封后放 4℃冰箱保存。 （三）計(jì)數(shù)原則與應(yīng)用 計(jì)數(shù)原則：涂布平板法里，平板上有 30 - 300 個(gè)菌落時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果比較準(zhǔn)。菌落太少，樣本量小誤差大；太多，菌落易重疊，都不好算。如果只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)在 30 - 300 之間，就用這個(gè)數(shù)除以涂布體積（一般是 0.1ml），再乘以稀釋倍數(shù)，就是樣品的細(xì)菌總數(shù)。比如，平板上有 150 個(gè)菌落，用的是 10⁻⁴ 稀釋度的菌液，涂布體積 0.1ml，那細(xì)菌總數(shù)就是（150÷0.1）×10⁴=1.5×10⁷ 個(gè)/g（假設(shè)樣品 1g）。如果有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)都合適，就看它們菌落總數(shù)的比值。比值小于 2，取平均值；大于 2，取較小的數(shù)。比如，10⁻⁴ 稀釋度平板上 120 個(gè)菌落，10⁻⁵ 的上 100 個(gè)，比值 1.2 小于 2，那細(xì)菌總數(shù)就是 [（120÷0.1）×10⁴ +（100÷0.1）×10⁵]÷2=6.1×10⁷ 個(gè)/g 。 應(yīng)用場(chǎng)景：涂布平板法在微生物領(lǐng)域用處多。在食品微生物檢測(cè)上，能測(cè)食品中微生物數(shù)量，看衛(wèi)生質(zhì)量和安不安全。像測(cè)牛奶細(xì)菌總數(shù)，就能知道污染情況，判斷是否達(dá)標(biāo)。在環(huán)境微生物研究里，能分析土壤、水體等環(huán)境樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化。分離計(jì)數(shù)不同環(huán)境里的微生物，能研究環(huán)境因素對(duì)它們的影響，給環(huán)境監(jiān)測(cè)和生態(tài)保護(hù)做數(shù)據(jù)支持。在工業(yè)微生物發(fā)酵時(shí)，能監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中微生物生長(zhǎng)，優(yōu)化條件，提高效率和質(zhì)量。比如釀酒，測(cè)發(fā)酵液中酵母菌數(shù)量，保障發(fā)酵正常。 方法三：傾注平板法 （一）工作原理 傾注平板法的原理其實(shí)就是利用微生物能生長(zhǎng)的特點(diǎn)，再加上稀釋涂布的基本思路。先對(duì)微生物懸液進(jìn)行逐步稀釋，稀釋的目的就是把微生物細(xì)胞分開來，讓它們不至于太擠。稀釋好之后，取少量稀釋后的懸液，跟已經(jīng)化開又冷卻到45 -50℃的無菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混在一起，這個(gè)溫度剛剛好，培養(yǎng)基還是液態(tài)，能和菌液充分混勻，又不會(huì)燙死微生物。接著把混合液趕緊倒進(jìn)無菌培養(yǎng)皿里，等培養(yǎng)基凝固了，微生物細(xì)胞就被固定在培養(yǎng)基里或者表面上了。在合適的溫度、濕度條件下，微生物細(xì)胞就開始生長(zhǎng)、繁殖，分裂了好多次之后，就能長(zhǎng)出肉眼能看到的菌落。一個(gè)菌落就是一個(gè)細(xì)胞繁殖出來的，理論上每個(gè)菌落都是純種微生物。要是挑出單個(gè)菌落，再做成新的微生物懸液，重復(fù)之前的那些步驟，比如稀釋、混合、倒平板，重復(fù)幾次，就可以把雜菌去掉，得到更純的培養(yǎng)物了。 （二）操作流程與要點(diǎn) 配培養(yǎng)基：按目標(biāo)微生物的要求選合適的培養(yǎng)基配方。比如培養(yǎng)大腸桿菌，用 LB 培養(yǎng)基就行。把配好的培養(yǎng)基裝進(jìn)三角瓶，塞緊棉塞，包好后放高壓鍋里滅菌。在 121℃下滅 15 - 20 分鐘，把培養(yǎng)基里的微生物和芽孢都?xì)⑺�。滅完菌的培養(yǎng)基放 45 - 50℃的水浴鍋預(yù)熱，保持液態(tài)，方便和菌液混合。 標(biāo)記培養(yǎng)皿：在超凈工作臺(tái)這種無菌地方，取無菌培養(yǎng)皿，用記號(hào)筆在底部寫上培養(yǎng)基名字、菌液稀釋度、接種日期、樣品編號(hào)等信息，方便后面區(qū)分和管理。 接種菌液：用無菌移液槍或吸管，吸 1ml 經(jīng)過梯度稀釋的微生物懸液，放到空培養(yǎng)皿中央。注意移液器具前端別碰培養(yǎng)皿邊緣等可能被污染的地方，保證菌液純凈。 倒培養(yǎng)基：從水浴鍋取出預(yù)熱好的培養(yǎng)基，右手握三角瓶瓶頸，在酒精燈火焰上快速燒一下瓶口滅菌，防止雜菌污染。然后快速把培養(yǎng)基倒進(jìn)有菌液的培養(yǎng)皿中央，倒 15 - 20ml，讓培養(yǎng)基能蓋住整個(gè)菌液，在培養(yǎng)皿里形成合適厚度。 混合培養(yǎng)基：倒完培養(yǎng)基后，馬上雙手握住培養(yǎng)皿，輕輕順時(shí)針和逆時(shí)針交替轉(zhuǎn)，讓菌液和培養(yǎng)基混勻。轉(zhuǎn)的時(shí)候速度和力度要合適，別產(chǎn)生太多氣泡，也別用力過猛讓培養(yǎng)基溢出，同時(shí)要快點(diǎn)操作，防止培養(yǎng)基凝固。 等培養(yǎng)基凝固：把混合好的培養(yǎng)皿放平，靜置等培養(yǎng)基凝固。過程中別動(dòng)培養(yǎng)皿，以免影響培養(yǎng)基平整度和菌落分布。一般室溫下 15 - 30 分鐘就能凝固。 培養(yǎng)：凝固后，把培養(yǎng)皿倒著放恒溫培養(yǎng)箱里，按微生物生長(zhǎng)條件培養(yǎng)。多數(shù)細(xì)菌在 37℃培養(yǎng) 24 - 48 小時(shí)，真菌在 25℃左右培養(yǎng) 3 - 5 天。倒置培養(yǎng)皿能防止冷凝水滴落，影響菌落生長(zhǎng)和形態(tài)，也能少雜菌污染。 計(jì)數(shù)和挑單菌落：培養(yǎng)結(jié)束后，取培養(yǎng)皿，選菌落數(shù)在 30 - 300 個(gè)的平板計(jì)數(shù)，記錄菌落數(shù)。要純培養(yǎng)物的話，用無菌接種環(huán)挑平板上形態(tài)典型、孤立的單菌落，接種到新的液體或斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)。挑菌落時(shí)，讓接種環(huán)只接觸目標(biāo)菌落，別碰周圍雜菌。 重復(fù)操作：把挑取的單菌落制成新的微生物懸液，再做梯度稀釋、混合培養(yǎng)基、傾注培養(yǎng)等操作，重復(fù) 2 - 3 次，提高微生物純度，確保得到純種培養(yǎng)物。 三種方法的比較與選擇 這三種微生物分離培養(yǎng)法各有特點(diǎn)，科研人員會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和條件選擇合適的方法。 操作難度上，平板劃線法最簡(jiǎn)單，步驟少，要求低，易上手；涂布平板法復(fù)雜些，得梯度稀釋、無菌操作，對(duì)技巧和耐心要求高；傾注平板法最繁瑣，需梯度稀釋、控溫，操作稍有不慎就影響結(jié)果。 適用場(chǎng)景方面，平板劃線法適合分離要求高的實(shí)驗(yàn)，如從混菌中分離純種，用于鑒定等；涂布平板法常用于計(jì)數(shù)和篩選；傾注平板法適用于初步估計(jì)數(shù)量和分離對(duì)熱不敏感微生物。 分離效果上，平板劃線法操作得當(dāng)分離效果好；涂布平板法通常較好且易控制；傾注平板法受限多，但多次操作也能純化。 計(jì)數(shù)能力方面，平板劃線法一般不能計(jì)數(shù)，涂布和平注法都能計(jì)數(shù)，但涂布法更準(zhǔn)確。 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫(kù)與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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