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科研戰(zhàn)神來(lái)了新蟲 (小有名氣)
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Southern/Northern/Western/Eastern Blot，有什么區(qū)別呢
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在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，Blot相關(guān)實(shí)驗(yàn)是常見實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可以檢測(cè)DNA，RNA，蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)修飾，除了我們常見的Western Blot,還有Southern、Northern、Eastern Bloto,那么他們有什么區(qū)別呢？誰(shuí)可以測(cè)DNA？誰(shuí)可以測(cè)RNA呢？ 01什么是Blot印記實(shí)驗(yàn)? Blot 印記實(shí)驗(yàn)的實(shí)質(zhì)是從復(fù)雜的混合樣本中，找到并且標(biāo)記我們所需要的目標(biāo)分子，實(shí)際流程包括：①分離：通過凝膠電泳（瓊脂糖或者聚丙烯酰胺凝膠等），將樣本中的 DNA、RNA 或蛋白質(zhì)按分子量大小、電荷差異等特性分開②轉(zhuǎn)膜：將分離好的條帶，從凝膠上轉(zhuǎn)移到固相載體上（如PVDF膜或者NC膜等），這邊這個(gè)過程就稱為Blot③雜交或者孵育：使用可以特異性識(shí)別目標(biāo)分子的 “探針”（針對(duì)核酸）或 “抗體”（針對(duì)蛋白質(zhì)）與膜孵育，這些分子 就會(huì)特異性目標(biāo)分子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別。④檢測(cè)：通過化學(xué)發(fā)光、顯色、放射性自顯影等技術(shù)，讓結(jié)合了探針 / 抗體的目標(biāo)分子顯現(xiàn)出來(lái)，從而判斷目標(biāo)分子是否存在、含量多少、分子量大小等。 02什么是Western blot？ 檢測(cè)對(duì)象：蛋白質(zhì)；核心工具：特異性抗體（一抗結(jié)合目標(biāo)蛋白，二抗結(jié)合一抗并攜帶檢測(cè)標(biāo)記）；關(guān)鍵特征：使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后需封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)；常見用途：檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量、蛋白質(zhì)的分子量鑒定、蛋白質(zhì)的翻譯后修飾判斷（如磷酸化蛋白檢測(cè)）。實(shí)驗(yàn)步驟：蛋白提取—蛋白定量—制膠—加樣—SDS-PAGE電泳—轉(zhuǎn)膜—封閉—抗原-抗體雜交（一抗孵育、二抗孵育）—底物顯色。 03什么是Northern Blot？ 檢測(cè)對(duì)象：蛋RNA（mRNA、rRNA、tRNA等，最常用mRNA）；核心工具：DNA或RNA探針（與目標(biāo)RNA互補(bǔ)）；關(guān)鍵特征：全程需嚴(yán)格防RNA酶污染（RNA易降解），用變性瓊脂糖凝膠電泳分離RNA（保證RNA線性化）；常見用途：檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄水平（mRNA表達(dá)量）、RNA的大小和完整性、基因的時(shí)空表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)步驟：RNA提取—RNA變性處理—制膠—電泳—轉(zhuǎn)膜—固定—探針制備—探針純化及比活性檢測(cè)—預(yù)雜交—探針變性—雜交—洗膜—曝光—去除膜上探針—顯影。 04什么是Southern Blot？ 檢測(cè)對(duì)象：雙鏈DNA（基因組DNA、質(zhì)粒DNA等）；核心工具：DNA探針（能和目標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合）關(guān)鍵特征：需要先對(duì)DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，再用瓊脂糖凝膠電泳分離；常見用途：檢測(cè)特定基因是否存在（如轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定）、基因拷貝數(shù)分析、DNA片段突變檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟：DNA提取—DNA檢測(cè)—制膠—瓊脂糖凝膠電泳—凝膠預(yù)處理（DNA變性）—轉(zhuǎn)膜—固定—探針標(biāo)記—預(yù)雜交封閉—雜交—洗膜—壓片—放射自顯影 05什么是Eastern Blot？ 檢測(cè)對(duì)象：蛋白質(zhì)；核心工具：特異性抗體（一抗結(jié)合目標(biāo)蛋白，二抗結(jié)合一抗并攜帶檢測(cè)標(biāo)記）關(guān)鍵特征：用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后需封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)（避免抗體非特異性結(jié)合）;常見用途：側(cè)重于檢測(cè)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾初步判斷（如磷酸化蛋白的初步篩選）。 |
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