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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 流式細(xì)胞術(shù)操作流程及關(guān)鍵注意事項(xiàng)
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流式細(xì)胞術(shù)是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究中不可或缺的技術(shù)手段，尤其在胞內(nèi)蛋白檢測(cè)（如ERK）方面，標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程與精準(zhǔn)的細(xì)節(jié)把控是實(shí)驗(yàn)成功的核心。本文結(jié)合Abmart ERK抗體（貨號(hào)T40071）的應(yīng)用實(shí)例，詳細(xì)梳理流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色的操作流程、關(guān)鍵要點(diǎn)、常見問題及解決方案，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供參考。 一、細(xì)胞刺激與固定 這一步驟直接影響抗原表位的完整性，時(shí)間控制是重中之重。 1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，可預(yù)先接種過夜或直接使用懸浮細(xì)胞，保證細(xì)胞狀態(tài)的均一性。 2. 刺激處理：將細(xì)胞分為未刺激組（陰性對(duì)照）和刺激組（實(shí)驗(yàn)組/陽性對(duì)照）；向刺激組加入預(yù)熱的刺激劑（如PMA），輕輕混勻后立即放回培養(yǎng)箱；刺激時(shí)間需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定（通常5-15min），建議對(duì)不同處理組進(jìn)行錯(cuò)時(shí)刺激，確保每個(gè)樣品都能被準(zhǔn)時(shí)固定。 3. 快速固定：刺激時(shí)間結(jié)束時(shí)，立即加入等體積預(yù)冷（4℃）的2% PFA固定液，邊加邊渦旋使細(xì)胞與固定液瞬間混勻；隨后在4℃條件下固定15-20分鐘，切勿超過30分鐘，防止過度交聯(lián)影響抗原表位；固定結(jié)束后，加入2-3倍體積的冷染色緩沖液，以300-400g、4℃離心5分鐘，棄上清后洗滌兩次，徹底去除PFA。 二、透化與胞內(nèi)染色 透化的效果和抗體染色的條件，決定了熒光信號(hào)的特異性與信噪比。 1. 細(xì)胞透化：渦旋振蕩重懸細(xì)胞沉淀，在振蕩狀態(tài)下緩慢逐滴加入預(yù)冷（-20℃）的90%冰甲醇（體積至少為細(xì)胞沉淀的10倍）；于冰上或-20℃條件下透化至少30分鐘，透化后的細(xì)胞可在-20℃冰甲醇中保存數(shù)周至數(shù)月，穩(wěn)定性良好；染色前，用足量冷染色緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，因冰甲醇會(huì)降低細(xì)胞密度，需將離心速度提高至500-600g，以徹底去除甲醇。 2. 抗體染色：用染色緩沖液重懸細(xì)胞，分裝至各流式管（每管約0.5-1×10⁶個(gè)細(xì)胞）；加入適量含5%正常血清的染色緩沖液，室溫避光封閉10-15分鐘，減少非特異性結(jié)合；離心棄上清后，按預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳稀釋度（如Abmart ERK抗體T40071按1:200稀釋）加入100μL稀釋后的一抗，輕輕重懸細(xì)胞；室溫避光孵育1小時(shí)，或4℃孵育過夜（背景可能更低）；用2mL冷染色緩沖液離心洗滌2次后，加入按說明書推薦濃度稀釋的熒光二抗（如1:500），室溫避光孵育30-45分鐘；再次用2mL冷染色緩沖液離心洗滌2次，最終用300-500μL染色緩沖液或PBS重懸細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)后待上機(jī)檢測(cè)。 抗體選擇要點(diǎn)：需選用貨號(hào)標(biāo)注適用于FC（流式細(xì)胞術(shù)）的抗體，如本實(shí)驗(yàn)中使用的Abmart ERK抗體（貨號(hào)T40071）。 三、流式數(shù)據(jù)采集與分析 規(guī)范的上機(jī)操作與數(shù)據(jù)分析方法，能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與可比性。 1. 上機(jī)前準(zhǔn)備：確保流式細(xì)胞儀完成CS&T或QC質(zhì)控；用未染色細(xì)胞調(diào)節(jié)FSC和SSC電壓，圈定目標(biāo)細(xì)胞群（P1門）；借助單染對(duì)照（僅二抗）或同型對(duì)照，調(diào)節(jié)熒光通道的電壓和補(bǔ)償。 2. 數(shù)據(jù)采集：上機(jī)前充分混勻樣本；每個(gè)樣本采集10,000-20,000個(gè)目標(biāo)門內(nèi)細(xì)胞（P1門）；將數(shù)據(jù)保存為FCS標(biāo)準(zhǔn)格式文件，便于后續(xù)分析。 3. 數(shù)據(jù)分析：在目標(biāo)細(xì)胞群（P1）內(nèi)分析熒光信號(hào)，核心參數(shù)包括平均熒光強(qiáng)度（MFI）/中位熒光強(qiáng)度（Median FI）、刺激指數(shù)（SI=刺激組MFI/未刺激組MFI）、陽性細(xì)胞百分比（根據(jù)同型對(duì)照或未刺激對(duì)照設(shè)定陽性閾值M1門計(jì)算）；結(jié)果呈現(xiàn)建議使用疊加直方圖，直觀展示pERK表達(dá)變化。 四、常見問題與解決方案 1. 信號(hào)弱：多因刺激-固定間隔過長(zhǎng)，需確保1分鐘內(nèi)完成固定，提前準(zhǔn)備好所有試劑和計(jì)時(shí)器。 2. 背景高：源于固定后洗滌不充分、殘留PFA干擾，需洗滌2次以上，固定液必須預(yù)冷并與細(xì)胞充分混勻。 3. 透化后FSC/SSC圖形改變：這是冰甲醇導(dǎo)致細(xì)胞收縮的正�，F(xiàn)象，以透化后未染色樣本設(shè)門即可。 4. 非特異性染色：需優(yōu)化封閉條件，用同型對(duì)照嚴(yán)格設(shè)門，確保二抗特異性，同時(shí)進(jìn)行抗體滴定確定最佳濃度。 5. 對(duì)照不全：流式實(shí)驗(yàn)需設(shè)置未刺激/未染色、未刺激/同型、刺激/同型、刺激/一抗+二抗四類對(duì)照，分別用于設(shè)門、調(diào)電壓和定陽性閾值。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示 流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色的每一步操作都需嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程，尤其在時(shí)間控制、試劑處理和對(duì)照設(shè)置上，只有把控好這些關(guān)鍵細(xì)節(jié)，才能獲得穩(wěn)定、可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 |
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