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我太秀了銅蟲 (小有名氣)
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一文了解基因敲除細(xì)胞系：概念、構(gòu)建流程、應(yīng)用場景、FAQ 已有1人參與
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在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，基因功能解析是探索疾病機制、開發(fā)靶向藥物的核心環(huán)節(jié)。而基因敲除細(xì)胞（Knockout Cell，簡稱 KO 細(xì)胞）作為研究基因功能的 “利器”，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研、藥物研發(fā)等多個領(lǐng)域。小源也曾在KO細(xì)胞構(gòu)建上吃過不少虧，所以根據(jù)多年的基因編輯經(jīng)驗總結(jié)了這篇文章，希望能夠幫助大家在KO細(xì)胞研究的路上少點坎坷。 什么是基因敲除細(xì)胞（KO 細(xì)胞）？ 基因敲除細(xì)胞（KO細(xì)胞） 是指在特定細(xì)胞中人為刪除或失活某個基因 ，從而使該細(xì)胞不再表達該基因編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。常用的方法如CRISPR-Cas9技術(shù)：利用Cas9核酸酶在目標(biāo)基因處產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后通過非同源末端連接（NHEJ）導(dǎo)致框移突變，使基因失活。 CRISPR-U™ 是源井生物自主研發(fā)的高效細(xì)胞基因編輯平臺，基于 CRISPR/Cas9 技術(shù)，結(jié)合獨特的 gRNA 設(shè)計算法、豐富的細(xì)胞系編輯參數(shù)數(shù)據(jù)庫、精確的 Pool 編輯效率檢測方法、單克隆形成率提升策略，以及適用于微量細(xì)胞的高通量基因型鑒定體系。在基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建方面，源井生物自主研發(fā)的 CRISPR-U™ 技術(shù)相較于傳統(tǒng)方法,可將基因編輯效率提升 10–20 倍。 為什么要做KO細(xì)胞？ 與普通細(xì)胞相比，KO 細(xì)胞的核心價值在于：通過 “去除” 某個基因，觀察細(xì)胞在生理、病理狀態(tài)下的表型變化（如增殖、凋亡、代謝異常等），進而反向推導(dǎo)該基因的生理功能，或明確其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。 簡單來說，KO 細(xì)胞就像 “基因功能的放大鏡”—— 當(dāng)某個基因被 “關(guān)閉” 后，細(xì)胞出現(xiàn)的異常變化，往往就是這個基因原本負(fù)責(zé)調(diào)控的生理過程，為科研人員提供直接的研究線索。 KO 細(xì)胞如何構(gòu)建？ 目前主流的KO 細(xì)胞構(gòu)建策略以 CRISPR/Cas9 技術(shù)為主，其原理是借助 gRNA 對靶序列的特異性識別，引導(dǎo) Cas9 核酸內(nèi)切酶在靶序列的 PAM 基序上游完成精準(zhǔn)切割，造成靶位點 DNA 雙鏈斷裂；隨后細(xì)胞啟動自身的 DNA 損傷修復(fù)應(yīng)答機制，將斷裂的 DNA 上下游末端直接連接，最終實現(xiàn)目標(biāo)基因的功能敲除。 （一）通用構(gòu)建流程：四步完成 KO 細(xì)胞制備 1.目標(biāo)基因與靶點設(shè)計 首先明確研究目標(biāo)（如敲除某致癌基因、代謝相關(guān)基因），通過基因數(shù)據(jù)庫（如 NCBI、Ensembl）獲取目標(biāo)基因的全長序列，選擇外顯子區(qū)域（尤其是編碼起始區(qū)或關(guān)鍵功能域） 作為編輯靶點 —— 此處敲除可最大程度確保基因失活，避免產(chǎn)生截短的功能性蛋白。 【小Tips】：可以選擇的情況下，敲除區(qū)域需要覆蓋所有轉(zhuǎn)錄本，如果無法選擇，優(yōu)先考慮主要轉(zhuǎn)錄本 (有CCDS編號的，NM開頭的) 2.基因編輯工具導(dǎo)入 根據(jù)選擇的技術(shù)（如 CRISPR/Cas9），構(gòu)建含靶點序列的編輯載體（如 sgRNA 載體 + Cas9 蛋白 / 載體），通過轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔）或病毒感染（慢病毒、腺病毒）的方式，將編輯工具導(dǎo)入宿主細(xì)胞（常見如 HEK293T、Hela、RAW264.7 等細(xì)胞系）。 【小Tips】：推薦使用源井紅棉·CRISPR基因編輯系統(tǒng)設(shè)計sgRNA，系統(tǒng)集成“基因風(fēng)險評估”、“表達量評估”、“拷貝數(shù)評估”等輔助小工具，可實現(xiàn)實驗方案的一鍵化風(fēng)險與難度評估，有效提升基因編輯設(shè)計效率與成功率。 3.陽性細(xì)胞篩選 編輯工具導(dǎo)入后，僅有部分細(xì)胞會發(fā)生目標(biāo)基因敲除，需通過篩選標(biāo)記（如抗生素抗性基因、熒光蛋白基因）篩選陽性細(xì)胞： 短期篩選：使用對應(yīng)抗生素（如嘌呤霉素、潮霉素）培養(yǎng)，淘汰未導(dǎo)入載體的細(xì)胞； 單克隆分選：通過有限稀釋法或流式細(xì)胞分選，獲得單個陽性細(xì)胞克隆，確保后續(xù)細(xì)胞的基因一致性。 4.敲除效果驗證 這是關(guān)鍵一步，根據(jù)需求選擇多層級驗證確認(rèn)基因已成功敲除： 基因型驗證：采用 PCR 擴增目標(biāo)基因區(qū)域，結(jié)合測序或電泳，確認(rèn)基因片段是否缺失； 蛋白水平驗證：通過 Western Blot 檢測目標(biāo)蛋白的表達量，若蛋白完全不表達，說明敲除成功； 表型驗證：觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)預(yù)期表型（如敲除凋亡抑制基因后，細(xì)胞凋亡率升高），進一步確認(rèn)敲除有效性。 （二）常見的幾種KO細(xì)胞構(gòu)建方法 1. 質(zhì)粒法 將攜帶有熒光、抗性標(biāo)簽的普通單質(zhì)粒載體，通過電轉(zhuǎn)或lipo的方式轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，載體上轉(zhuǎn)錄表達的sgRNA和Cas9蛋白組成有活性的復(fù)合體，對細(xì)胞基因組DNA進行打靶編輯，通過單克隆篩選獲得目標(biāo)敲除細(xì)胞株。 注：載體瞬時轉(zhuǎn)染，理論上不整合基因組，但也有一定概率被整合，可通過觀察最終單克隆是否攜帶熒光標(biāo)簽來判斷。 2.RNP法 體外合成的sgRNA序列，與Cas9蛋白孵育形成復(fù)合體后，通過電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，有活性的復(fù)合體直接對細(xì)胞基因組DNA進行打靶編輯，通過單克隆篩選獲得目標(biāo)敲除細(xì)胞株。 3. 病毒法 將gRNA和Cas9蛋白通過慢病毒載體，利用單質(zhì)�；螂p質(zhì)粒系統(tǒng)包裝慢病毒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使gRNA和Cas9序列隨機整合到細(xì)胞基因組DNA中，持續(xù)表達，通過單克隆篩選獲得目標(biāo)敲除細(xì)胞株。 KO 細(xì)胞的應(yīng)用場景與經(jīng)典案例 KO 細(xì)胞的應(yīng)用貫穿生命科學(xué)研究的多個領(lǐng)域，其核心價值在于 “明確基因功能” 和 “模擬疾病模型”，以下是KO細(xì)胞的核心應(yīng)用場景及經(jīng)典案例： （一）基礎(chǔ)科研 在基礎(chǔ)研究中，KO 細(xì)胞是 “基因功能驗證的金標(biāo)準(zhǔn)”。通過對比 KO 細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異，可直接明確目標(biāo)基因在細(xì)胞代謝、信號通路、分化發(fā)育等過程中的作用。 案例：TP53 是著名的 “抑癌基因”，科研人員通過 CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建TP53-KO 的HCT116 細(xì)胞系，與正常 HCT116細(xì)胞對比發(fā)現(xiàn)：p53通過直接占據(jù)BCL-2的BH3結(jié)合口袋與之形成復(fù)合物，并通過釋放位于口袋的促凋亡BCL-2家族蛋白來拮抗BCL-2活性，從而促進細(xì)胞凋亡[1]。 （二）藥物研發(fā) 在藥物研發(fā)中，KO 細(xì)胞可用于 “靶點驗證” 和 “藥物篩選”，避免因靶點錯誤導(dǎo)致的研發(fā)失敗。 案例：ZNF蛋白被證實為調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞基因組完整性的關(guān)鍵因子，為探究ZFP可作為基于同源重組(HR)的DNA修復(fù)效應(yīng)器的可能性，拉瓦爾大學(xué)Jean-Yves Masson 團隊采用源井構(gòu)建的U2OS敲除ZNF432細(xì)胞系進行了一系列實驗，發(fā)現(xiàn)ZNF432在癌細(xì)胞中缺失會加速DNA修復(fù)，導(dǎo)致PARPi作用減弱，使卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，證實ZNF432是一種新的HR抑制因子，成功拓寬了研究PARPi療效的新途徑[2]。 （三）疾病模型 部分人類疾病由單基因缺失或突變引起（如囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞貧血），KO 細(xì)胞可作為 “體外疾病模型”，用于研究疾病機制或測試治療方案。 案例：研究對494例來自中國不同地區(qū)的肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織進行了高深度的全基因組測序（平均120x），深入分析了編碼區(qū)和非編碼區(qū)的驅(qū)動基因、突變印記、拷貝數(shù)變異、聚集式變異事件（clustered alteration：chromothripsis, chromoplexy和kataegis）、染色體外環(huán)狀DNA（extrachromosomal circular DNA, ecDNA）以及突變演進規(guī)律等特征。還選取了3個新鑒定的潛在驅(qū)動事件進行詳細(xì)功能驗證，綜合CRISPR定點突變及多個細(xì)胞系敲降/敲除實驗，發(fā)現(xiàn)上述基因的突變足以導(dǎo)致基因表達水平的顯著變化（其中PPP1R12B, KCNJ12, FGA基因敲除細(xì)胞和攜帶突變位點的過表達慢病毒均由源井生物構(gòu)建），并參與調(diào)控肝細(xì)胞癌的多種惡性表型，這些結(jié)果證實基于數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)的新驅(qū)動事件的有效性[3]。 KO 細(xì)胞常見 FAQ Q1：CRISPR/Cas9 構(gòu)建 KO 細(xì)胞時，如何降低脫靶風(fēng)險？ 1.gRNA設(shè)計優(yōu)化：使用在線工具設(shè)計靶點，選擇 “脫靶評分高” 的序列（通常要求靶點在基因組中唯一，或僅與其他序列有 2 個以上堿基差異）； 2.使用 Cas9切口酶：將 Cas9 改造為僅切割單鏈的切口酶，需同時導(dǎo)入 2 個 sgRNA 靶向相鄰區(qū)域，才能形成雙鏈斷裂，大幅提高特異性； 3.脫靶檢測驗證：通過全基因組測序或靶向測序，檢測潛在脫靶位點（如與靶點序列相似的區(qū)域），確認(rèn)無脫靶后再使用細(xì)胞。 Q2：sgRNA 設(shè)計有哪些注意事項？ 1.確保gRNA的特異性，避免發(fā)生較多的脫靶編輯; 2..gRNA序列盡量覆蓋較多的轉(zhuǎn)錄本; 3.避免RNA序列靠近編碼蛋白的N端或C端，發(fā)生外顯子跳躍等機制，產(chǎn)生截短的蛋白異構(gòu)體; 4.避免重復(fù)序列，減少非特異性剪切的可能性; 5.確保序列不含二級結(jié)構(gòu)，提高其有效性; 6.使用T7/U6啟動子驅(qū)動sgRNA表達時，5’端堿基最好為G，或人為添加一個G提高轉(zhuǎn)錄效率。 7.使用源井紅棉·CRISPR基因編輯系統(tǒng)設(shè)計sgRNA，只需輸入基因和細(xì)胞名稱，一鍵生成3套gRNA方案。 Q3：構(gòu)建 KO 細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白仍有少量表達，是什么原因？如何解決？ 這種情況稱為 “不完全敲除”，常見原因及解決方法如下： 原因 1：基因敲除不徹底（如僅敲除了等位基因中的一個，即雜合子敲除）：通過 PCR 測序確認(rèn)基因型，篩選純合子敲除的單克隆細(xì)胞； 原因 2：靶點選擇不當(dāng)（如敲除的外顯子區(qū)域不影響蛋白核心功能，導(dǎo)致產(chǎn)生截短的功能性蛋白）：重新設(shè)計靶點，選擇編碼起始區(qū)或關(guān)鍵功能域的外顯子，重新構(gòu)建 KO 細(xì)胞； 原因 3：細(xì)胞污染或混克�。和ㄟ^單克隆分選重新獲得純克隆，并用 Western Blot 再次驗證蛋白表達。 原因4：抗體特異性低，如果是出現(xiàn)很多雜帶，或者條帶單一但是與理論大小差距較大的，也可能是非特異性條帶。 歡迎大家在評論區(qū)留下你在構(gòu)建KO細(xì)胞時遇到的困難,我們一起討論~ |
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