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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
是否清楚Western Blot中 濃縮膠和分離膠的區(qū)別與作用 已有1人參與
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1什么是Western blot?蛋白質(zhì)免疫印跡是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的技術(shù)，通過電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜后利用抗體特異性結(jié)合來檢測樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的技術(shù)。主要步驟包括：①電泳分離（使用凝膠把混合蛋白按分子量大小分開，就是我們今天聊的環(huán)節(jié)）；②轉(zhuǎn)膜（把凝膠上的蛋白“轉(zhuǎn)移”到硝酸纖維素膜或PVDF膜等載體上）；③孵育（用特異性抗體孵育目的蛋白）；④顯影（通過化學(xué)發(fā)光等方式讓目的蛋白顯現(xiàn)形成清晰條帶）。 而完成這一切的前提，就是①電泳能把蛋白清晰的分開，也就是需要使用到分離膠，使用分離膠我們可以很好的理解，但是實(shí)驗(yàn)過程還需要濃縮膠的配合，那么為什么呢？ 2分離膠與濃縮膠的成分差異 3濃縮膠的作用濃縮膠，顧名思義，就是將蛋白樣本進(jìn)行濃縮，使得樣本孔中的蛋白質(zhì)樣本壓縮到一條窄窄的起跑線，確保所有的樣本同時(shí)進(jìn)入分離膠分離。為什么它能做到濃縮這一點(diǎn)呢？首先濃縮膠的濃度通常很低（一般為5%），所以對(duì)應(yīng)的凝膠孔徑大；其次，濃縮膠的pH值通常為6.8，而分離膠是8.8，這種pH差異源于兩者緩沖液成分的不同——濃縮膠用Tris-HCl（pH6.8），分離膠用Tris-HCl（pH8.8）在電泳的時(shí)候，緩沖液里的氯離子（Cl⁻）是跑得最快，甘氨酸（在pH6.8環(huán)境中解離少，帶電荷少）是跑得較慢，而蛋白質(zhì)介于兩者之間。當(dāng)電場啟動(dòng)后，氯離子快速向前沖，甘氨酸慢悠悠跟在后面，兩者之間形成一個(gè)“低離子濃度區(qū)”。蛋白質(zhì)會(huì)被這個(gè)“濃度差”推著向前，逐漸聚集到氯離子和甘氨酸之間的“夾縫”里，原本分散在孔里的樣品，就被壓縮成了一條極窄的條帶。 4分離膠的作用分離膠，顧名思義，就是用來分離蛋白的啦。分離膠濃度更高（8%-15%），孔徑更小。成分上，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺總用量高于濃縮膠（縮小孔徑），緩沖液為pH8.8的Tris-HCl（維持分離環(huán)境）。這種小孔徑結(jié)構(gòu)形成分子篩效應(yīng)：小分子蛋白易穿過孔徑，遷移至凝膠下方；大分子蛋白受阻，停留于上方，實(shí)現(xiàn)按分子量排序分離。此外pH8.8的堿性環(huán)境還能讓甘氨酸大量解離為帶負(fù)電的甘氨酸根，移動(dòng)速度超過蛋白質(zhì)，使蛋白失去“推動(dòng)”作用，僅靠自身電荷和分子篩效應(yīng)遷移。 |
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