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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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實驗技術分享 | 手把手教你成骨細胞茜素紅ARS染色（實用版）
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一、備品 1. 我用的成骨細胞MC3T3，如果是原代，可以參考我的步驟。MC3T3有兩種分型，24型側(cè)重增殖，14型側(cè)重成骨分化，強烈建議選擇4/5代的MC3T3-14型細胞進行試驗，成功率高。 2. 用十二孔板做，換液方便，拍照也方便，容易出現(xiàn)差異結果。 3. 成骨誘導劑我是自己配的，用的我?guī)熜值呐浞�，此處作為引用：�?0%FBS的αMEM培養(yǎng)基500ml + 抗壞血4.40mg + B-甘油磷酸二鈉1.53g + 地塞米松0.0196mg。這個試劑用量太微小，可以先配母液50ml（五瓶用量，每瓶500ml培養(yǎng)基加10ml），40ml純水 + 22mg抗壞血酸 + 7.65g B-甘油磷酸二鈉 +0.098mg 地塞米松（地米需溶于無水乙醇，25ml無水乙醇 + 100mg地塞米松，每瓶取5微升，也就是上述母液50ml加25微升地米母液）。 4. 成骨誘導液配好后，過三遍0.22的濾膜，然后凍到負二十，如果凍存超過一周，解凍后建議再次過濾，過濾后再加入培養(yǎng)基里。 5. 染液我用的OriCell的，確實好用，當然，這只是參考，大家愛用啥用啥。 二、操作1. 首先，我用0.1%明膠包被了板子（成品明膠溶液稀釋后，十二孔板，每個空一毫升，四周纏封口膜，扔細胞箱里四小時，然后把液體吸走，再鋪板），好處是細胞及其耐造，基本不會卷邊，不會飄。缺點是明膠容易粘一些雜質(zhì)，什么棉花絲之類的，不干凈，而且高倍鏡拍照的時候麻麻賴賴不光滑。建議稀釋好的明膠過兩次0.22濾膜再鋪板。 2. 細胞鋪板濃度隨意，差不多就行，因為養(yǎng)到最后都是滿滿的，建議濃度是鋪進去第二天就能長到100%。但是必須確保細胞狀態(tài)良好無污染，黑膠蟲和支原體都是致命的，務必確認。 3. 換液最講究，請嚴格按我說的做。 (1) 第一階段（1周）：鋪板24H后第一次換液，十二孔板（下同）每孔2ml。建議用不加誘導劑的培養(yǎng)基，有條件可以使用加可樂必妥的培養(yǎng)基（確保清除支原體），再次培養(yǎng)3-5天（隔天換半量液體，確保細胞完全長滿，而且沒有支原體/黑膠蟲污染）。 (2) 第二階段（2-3周）：此階段第1周根據(jù)細胞情況，加入正常培養(yǎng)基和誘導培養(yǎng)基1:1混合后的混合培養(yǎng)基，第2周及以后全部換為誘導培養(yǎng)基�；驹瓌t，隔天換液，每次半量，觀察培養(yǎng)基，如果顏色不是淡粉色，變成透明黃色，那不用等隔天換液，應該立即換液（說明培養(yǎng)基沒有營養(yǎng)了）。此階段細胞大量增殖分化，需要勤觀察，勤換液。一旦營養(yǎng)不足，細胞老化凋亡，實驗失�。灰坏┧兰毎逊e，極其容易引起真菌感染，實驗失��；一旦換液力度過大還沒有包被，膜翹邊打卷，實驗失敗。這個階段離成骨還有距離，如果感覺細胞表面不干凈，該沖洗沖洗，不用怕。 (3) 第三階段（1-2周）：實驗沖刺階段，也是成骨關鍵階段，標志為成骨細胞增殖結束，開始分化，直觀表現(xiàn)為培養(yǎng)基隔天換液時，舊的培養(yǎng)基仍然保持淡粉色，不會變?yōu)榈S透明，意味著細胞旺盛分裂停止，基本不會一兩天就把營養(yǎng)消耗完。此時也是成骨的開始，立刻停止頻繁換液，不然會影響細胞成骨，因為頻繁換液一是破壞培養(yǎng)基酸堿平衡，二是會沖走表面生成的一丟丟鈣。此階段直接每孔加入2.5-3ml誘導培養(yǎng)基（基本加滿），然后注意觀察就可以，不用嚴格隔幾天換液，只要培養(yǎng)基整體是粉色，細胞狀態(tài)不變，就不用換液，如果不放心，可以三到四天換1ml，不論吸取還是打入，動作一定輕柔，不要碰到底部。 三、判斷1. 什么時候開始成骨？細胞表面出現(xiàn)模糊影，高倍鏡下，部分細胞內(nèi)有區(qū)別于凋亡小體的小透明圓球。 2. 什么時候能染出顏色？肉眼見皿底部有團塊狀云霧影，鏡下感覺有團塊狀物體覆蓋在細胞表面，不是死細胞，是由沒有細胞結構的小點點組成。 3. 怎么判斷污染？(1) 支原體污染：細胞觸角拉長，高倍鏡下，膜表面有黑點。處理方法：可以嘗試用支原體清除劑+可樂必妥處理。 (2) 黑膠蟲污染：細胞不貼壁，大量漂浮，培養(yǎng)基迅速變黃，高倍鏡下密密麻麻會動的小黑點。處理方法：板子直接扔掉，重新做。 (3) 真菌感染：多發(fā)生在加誘導培養(yǎng)基之后，死細胞過多，孔板內(nèi)培養(yǎng)基中出現(xiàn)云霧狀懸浮物，細胞大量死亡，旋轉(zhuǎn)晃動板子，云霧狀會聚集到中央。處理方法：誘導初期，隔一段時間徹底換液，輕輕洗一下細胞，一旦已經(jīng)污染，建議直接拿去染ALP，或者扔掉，繼續(xù)養(yǎng)會傳染別的細胞。 四、染色拍照1. 如果鏡下觀察到了大量鈣結節(jié)，那么恭喜你，可以染色了。 (1) 首先，輕柔吸去培養(yǎng)基（決不允許倒扣甩干培養(yǎng)基，把鈣結節(jié)都甩飛了） (2) 不用洗！也不用固定！ 直接貼壁輕柔加入ARS染液200-500微升/孔（不要大力，更不能對著皿底大，不然會把膜和鈣結節(jié)吹壞，白干了）。如果成功，會在一兩分鐘內(nèi)迅速看到初步的鈣結節(jié)染色，但是別急，等二十分鐘，然后輕柔吸出染液，這時候能看出紅色點點/團塊就是鈣結節(jié)，不過背景不干凈，都是紅色。 (3) 輕柔貼壁加入ddH2O（不許用別的，就用超純水），500微升/孔，等2-5分鐘，吸去，背景就變得干凈了。 2. 拍照我建議留兩種圖片，一種是用打光板拍整體板子照片，還有完整單個孔照片，另一種是倒置顯微鏡下4X或者10X照片。 3. 最后把板子陰干，必要的時候可以復水重拍。 |
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