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【Commun. Chem.】生物催化動(dòng)力學(xué)拆分用于δ-鹵代醇與四氫呋喃類化合物的合成
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導(dǎo)語(yǔ) 手性δ-鹵代醇與四氫呋喃是多種藥物分子（如抗精神病藥物和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素）的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元。然而，傳統(tǒng)化學(xué)合成方法通常依賴貴金屬催化劑與苛刻反應(yīng)條件，對(duì)映選擇性控制難度大；而現(xiàn)有生物催化策略（如酮還原酶）在實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程立體控制方面效率有限。鹵醇脫鹵酶（hhdh）雖具備催化雜泛性，但其應(yīng)用長(zhǎng)期受限于β-鹵代醇體系。如何突破其催化邊界，實(shí)現(xiàn)δ-鹵代醇的高效、高選擇性轉(zhuǎn)化，一直是該領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)。遵義醫(yī)科大學(xué)萬(wàn)南微課題組一直致力于鹵醇脫鹵酶生物催化技術(shù)研究，研究團(tuán)隊(duì)前期已成功將鹵醇脫鹵酶的催化功能拓展至γ-鹵代醇的立體選擇性脫鹵及氧雜環(huán)丁烷的選擇性開環(huán)（nat. commun., 2025, 16, 1170），詳見往期報(bào)道：https://mp.weixin.qq.com/s/9o2zdupkwq9lf3mzjlicqw。 在上述研究基礎(chǔ)上，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了鹵醇脫鹵酶在δ-鹵代醇動(dòng)力學(xué)拆分中的合成潛力。通過酶篩選與蛋白質(zhì)工程改造，成功開發(fā)了一種高效的生物催化動(dòng)力學(xué)拆分新方法，實(shí)現(xiàn)了手性δ-鹵代醇與四氫呋喃類化合物的對(duì)映選擇性互補(bǔ)合成。值得關(guān)注的是，該生物催化體系在放大反應(yīng)中可耐受高達(dá)1000 mm（185 g/l）的底物濃度，展現(xiàn)出優(yōu)異的工業(yè)化應(yīng)用前景。該研究成果以“biocatalytic kinetic resolution for efficient and enantioselective synthesis of δ-haloalcohols and tetrahydrofurans”為題，近期發(fā)表于communications chemistry（commun. chem., 2025, 8, 337, doi:10.1038/s42004-025-01713-w）。研究生王遠(yuǎn)飛、華夏為共同第一作者，課題組王慧慧老師為共同通訊作者。 圖1. 鹵醇脫鹵酶催化混雜性及其合成應(yīng)用（圖片來源：commun. chem.） 前沿科研成果 作者首先以催化外消旋4-氯-1-苯基-1-丁醇（1a）轉(zhuǎn)化為目標(biāo)反應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的多種重組野生型鹵醇脫鹵酶（hhdh）進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估，篩選范圍覆蓋a╟g組共38種酶。結(jié)果顯示，大多數(shù)酶的催化活性較低，僅有8種酶的轉(zhuǎn)化率超過10%，且產(chǎn)物的對(duì)映選擇性處于中低水平，生成的r型或s型2-苯基四氫呋喃（1b）光學(xué)純度介于62%╟89% ee。值得關(guān)注的是，來自農(nóng)桿菌（agrobacterium tumefaciens）ad1菌株的hhec酶表現(xiàn)最為突出，轉(zhuǎn)化率達(dá)59%，并展現(xiàn)出當(dāng)前最優(yōu)的對(duì)映選擇性（e=20）�；诖�，作者進(jìn)一步評(píng)估了實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建保存的17個(gè)hhec突變體。其中hhec-sm4 (t134l)、hhec-tm2 (f86v/t134v/n176g) 和 hhec-qm1 (p84v/f86p/t134a/n176a)三個(gè)優(yōu)良突變體在對(duì)映選擇性方面獲得顯著提升。特別是四點(diǎn)突變體hhec-qm1，在催化活性和r型對(duì)映選擇性方面表現(xiàn)尤為優(yōu)異（e > 200）。該突變體在僅15分鐘的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，即可實(shí)現(xiàn)20 mm外消旋底物1a的48%轉(zhuǎn)化，生成產(chǎn)物(r)-1b的光學(xué)純度高達(dá)99% ee，剩余底物(s)-1a也達(dá)到92% ee。進(jìn)一步的底物譜研究顯示，hhec-qm1對(duì)15種不同結(jié)構(gòu)的δ-鹵代醇均表現(xiàn)出良好的催化兼容性，涵蓋芳環(huán)、雜環(huán)（如噻吩）及烷基取代等多種類型。大部分底物在轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物收率介于39%╟50%，光學(xué)純度達(dá)86%╟>99% ee，其中芳環(huán)類底物的對(duì)映選擇性最優(yōu)。值得注意的是，即使面對(duì)萘環(huán)或α,α-二取代等空間位阻較大的底物，該酶仍能實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化，展現(xiàn)出廣泛的底物適用性。 圖2. 鹵醇脫鹵酶的篩選及r-對(duì)映選擇性脫鹵底物適用范圍（圖片來源：commun. chem.） 隨后，作者進(jìn)一步結(jié)合多維突變位點(diǎn)分析與分子對(duì)接模擬，揭示了鹵醇脫鹵酶hhec催化活性與對(duì)映選擇性之間的協(xié)同調(diào)控機(jī)制：酶分子中鹵離子結(jié)合區(qū)域（n176-y177-l178等殘基）負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合底；而底物結(jié)合區(qū)域（如p84、f86等殘基）則借助疏水作用與芳香相互作用穩(wěn)定底物取代基，從而調(diào)控其結(jié)合取向。兩個(gè)區(qū)域的協(xié)同作用共同實(shí)現(xiàn)了對(duì)δ-鹵代醇脫鹵反應(yīng)效率及立體選擇性的精準(zhǔn)控制。 圖3. δ-鹵代醇脫鹵反應(yīng)機(jī)理分析（圖片來源：commun. chem.） 圖4. 基于酶結(jié)構(gòu)的對(duì)映選擇性分析（圖片來源：commun. chem.） 為實(shí)現(xiàn)δ-鹵代醇的對(duì)映互補(bǔ)性脫鹵反應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)聚焦于通過蛋白質(zhì)工程改造hhec-wt，旨在提升其s型對(duì)映選擇性�；趯�(duì)酶催化機(jī)制的深入理解，團(tuán)隊(duì)針對(duì)p84、f86、t134、w139、n176和w249等關(guān)鍵殘基開展了系統(tǒng)的位點(diǎn)飽和突變研究。在t134位點(diǎn)的篩選中，研究確認(rèn)了已知突變體hhec-sm4（t134l）具有增強(qiáng)的對(duì)映選擇性。然而，進(jìn)一步在該位點(diǎn)構(gòu)建的17個(gè)新突變體均未表現(xiàn)出更優(yōu)性能。與此同時(shí)，從f86和n176的突變庫(kù)中分別鑒定出兩個(gè)有益單點(diǎn)突變體：hhec-sm11（f86w）與hhec-sm12（n176q）。其中，hhec-sm11表現(xiàn)出優(yōu)異的對(duì)映選擇性（e=111），在催化20 mm外消旋底物1a時(shí)實(shí)現(xiàn)48%轉(zhuǎn)化率，分別獲得95% ee的(s)-1b和87% ee的(r)-1a。作者進(jìn)一步通過定點(diǎn)突變構(gòu)建了三個(gè)雙點(diǎn)突變體：hhec-dm9（f86w/t134l）、hhec-dm10（f86w/n176q）和hhec-dm11（t134l/n176q）。然而，這些雙點(diǎn)突變體在催化效率與對(duì)映選擇性方面均未超越hhec-sm11。隨后，作者系統(tǒng)評(píng)估了這些s-對(duì)映選擇性酶在多種δ-鹵代醇底物中的適用性。為驗(yàn)證合成工藝的可放大性，研究以hhec-sm11全細(xì)胞作為s-選擇性生物催化劑，開展了代表性制備規(guī)模反應(yīng)，成功獲得手性(s)-四氫呋喃（產(chǎn)率43%╟49%，88%╟95% ee）與手性(r)-δ-鹵代醇（產(chǎn)率39%╟49%，90%╟>99% ee），充分證明了生物催化法實(shí)現(xiàn)四氫呋喃與δ-鹵代醇對(duì)映互補(bǔ)合成的可行性。 圖5. s-對(duì)映選擇脫鹵酶的改造及其底物譜研究（圖片來源：commun. chem.） 最后，作者進(jìn)一步驗(yàn)證了該生物催化技術(shù)的工藝適用性。在500 mm底物濃度下，突變體hhec-qm1反應(yīng)24小時(shí)可實(shí)現(xiàn)45%轉(zhuǎn)化率；通過調(diào)控反應(yīng)ph（維持ph 8.0±0.1），即使在1000 mm（185 g/l）超高濃度下反應(yīng)20小時(shí)，仍保持e > 200，產(chǎn)率達(dá)48%╟49%，并保持優(yōu)異的光學(xué)純度（95%╟97% ee），展現(xiàn)良好的工藝穩(wěn)定性與可放大潛力。此外，合成所得手性δ-鹵代醇可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為多種高價(jià)值衍生物，如用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的mrjf4類似物前體、一氧化氮合酶抑制劑前體等，凸顯了該生物催化技術(shù)在藥物中間體綠色合成中的廣闊應(yīng)用前景。 圖6. 該生物催化技術(shù)的合成實(shí)用性與可放大性（圖片來源：commun. chem.） 綜上所述，本研究中作者通過酶篩選與蛋白質(zhì)工程成功構(gòu)建了一種高效生物催化平臺(tái)，可用于動(dòng)力學(xué)拆分合成手性δ-鹵代醇與四氫呋喃類化合物，該平臺(tái)展現(xiàn)出優(yōu)異的底物耐受性、廣泛的底物普適性及高度的對(duì)映選擇性。該工作不僅進(jìn)一步拓展了鹵醇脫鹵酶的催化功能與應(yīng)用范圍，還通過反應(yīng)機(jī)制分析揭示了酶結(jié)構(gòu)與其催化功能之間的關(guān)系，為后續(xù)鹵醇脫鹵酶的理性設(shè)計(jì)與定向改造提供了可借鑒的理論依據(jù)。 論文信息 yuan-fei wang#, xia hua#, zhang-yang wang, xiao jin, hui-hui wang*, yong-zheng chen & nan-wei wan*. biocatalytic kinetic resolution for efficient and enantioselective synthesis of δ-haloalcohols and tetrahydrofurans. commun. chem., 2025, 8, 337. https://doi.org/10.1038/s42004-025-01713-w. |
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