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艾因斯新蟲 (小有名氣)
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[交流]
用于止血的含鉭介孔生物活性玻璃粉末
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介紹 止血是對血管損傷的一種高度調(diào)控和復(fù)雜的反應(yīng)，需要血管壁、血小板和凝血蛋白的成分來有效地止血。通常分為原發(fā)性止血和繼發(fā)性止血，原發(fā)性止血包括損傷后的血管反應(yīng)，隨后是血小板粘附、活化和聚集。當(dāng)內(nèi)皮下基質(zhì)蛋白暴露在損傷的血管壁中時，血小板粘附并激活，導(dǎo)致血小板表面被稱為整合素αIIbβ3的蛋白受體的構(gòu)象變化。血液中的配體，如纖維蛋白原（和其他蛋白質(zhì)）與整合素αIIbβ3受體結(jié)合，并連接活化的血小板。這將導(dǎo)致血小板聚集和血小板堵塞的形成，以防止受損者的出血。繼發(fā)性止血與原發(fā)性止血同時發(fā)生，涉及凝血級聯(lián)的內(nèi)在和外在途徑中的因素的激活。內(nèi)在途徑是由因子XII（FXII）啟動的，而外在途徑是由組織因子（TF）-因子VII（FVII）復(fù)合物啟動的。這些途徑匯聚到共同的凝血途徑，形成一個纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，穩(wěn)定血小板堵塞，進(jìn)一步防止出血。 生物活性玻璃（BGs）和介孔BGs（MBGs）被認(rèn)為是止血劑，因為它們的材料特性：高表面積，玻璃表面效應(yīng)（如下解釋），一個負(fù)的表面電荷和Ca2+離子的提供。一個較大的表面積，在數(shù)百m2g-1的范圍內(nèi)，有助于吸收血液中的液體成分，在損傷部位聚集凝血因子，激活凝血的內(nèi)在途徑。由于氧原子和金屬原子之間的電負(fù)性差異，眼鏡也有一個極性表面，這種極性增強(qiáng)了血液在與它們接觸時的凝固能力。這種效應(yīng)被稱為“冰川效應(yīng)”，通過增強(qiáng)內(nèi)在凝血途徑發(fā)揮作用。此外，帶負(fù)電荷的表面激活FXII，增強(qiáng)凝固的內(nèi)在途徑；通過測量水介質(zhì)中的zeta電位（ZP）來記錄材料的表面電荷。 將Ta（0~10mol%）加入Si-Ca-P MBG中，生成一系列含鉭的MBGs（Ta-MBGs），并研究其對物理、化學(xué)的影響并測定了止血性能。選擇Ta作為摻雜劑，以增強(qiáng)Si-Ca-P MBG固有的止血性能，因為氧化鉭具有抗菌和抗炎特性。氧化鉭粉已被提出用于止血，但其作為Si-Ca-P MBG中的摻雜劑來增強(qiáng)硅酸鹽MBG的止血。在Ta含量低時，這些Ta-mbg表現(xiàn)出六邊形介孔納米結(jié)構(gòu)，但隨著Ta增加到1 mol%以上，有序六角形通道開始出現(xiàn)不連續(xù)；被認(rèn)為是非橋接氧增加（玻璃系列中Ta mol%的增加）和Ta與其他MBG組分熱膨脹系數(shù)不匹配的結(jié)果。 含10mol% Ta的Ta-MBGs對介孔有序通道的破壞最大，導(dǎo)致表面積和孔隙體積減小。本研究中納入的初步小動物模型采用小鼠尾出血模型，證實了Ta-MBGs的止血潛力；與“不治療”相比，測量的使用顯著減少了出血時間（平均出血時間的≥50%）。 實驗 材料 采用試劑級三嵌段共聚物P123聚（乙二醇）嵌段聚（丙二醇）嵌段聚（乙二醇）、硝酸鈣（≥99.0%)、磷酸三乙酯（≥99.8%，TEP)、正硅酸四乙酯（98%，TEOS）、鉭(V)乙氧基（99.98%）和乙醇。用蒸餾水將試劑級鹽酸（鹽酸）稀釋至0.5N。 Ta-MBG的組成（mol%）。 合成 如表1所示，通過增加乙醇鉭（V）含量合成了MBGs，但犧牲了TEOS。鈣和磷的加入增加了生物活性，在整個系列中保持不變。 在適量的TEOS中加入1ml0.5N鹽酸，放在一邊進(jìn)行水解起始。在一個單獨(dú)的燒杯中，將4克P123和1.4克四水合硝酸鈣溶解在76 ml乙醇中。加入含P123和四水硝酸鈣的乙醇溶液，在乙醇溶液中加入0.68mlTEP和x mol%鉭(V)乙醇，最后在混合物中加入TEOS-HCl溶液。將溶液覆蓋并攪拌過夜，然后將溶液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中進(jìn)行蒸發(fā)誘導(dǎo)自組裝（EISA）。使用EISA，該溶液在大約一周內(nèi)轉(zhuǎn)化為凝膠。將衍生凝膠在650℃下以1℃min-1的加熱速率煅燒6小時將煅燒玻璃研磨碎，并通過45μm網(wǎng)篩分。所有進(jìn)一步的分析都在篩過的粉末上進(jìn)行。 Zeta電位測量 使用zeta電位分析儀測量BGs的ZP。稀釋的聚苯乙烯膠乳溶液用作校準(zhǔn)材料，去離子水用作分散介質(zhì)。將約2.5毫克樣品分散在10毫升去離子水中。將分散的樣品注入一次性折疊式毛細(xì)管池進(jìn)行ZP測量。每個樣品運(yùn)行n=3次，每次實驗重復(fù)三次，報告平均ZP（平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差）。 溶血試驗 在測試中，向含有2.5毫克樣品（n 5）的微量離心管中加入500μL血液。將試管輕輕倒置4-5次，使粉末與血液充分混合。試管在37℃孵育60分鐘；孵育后，將試管以2500 G離心10分鐘以收集上清液血漿。將含有200毫升血漿和1800毫升磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）的比色皿置于UV-3600 UV-VIS- NIR分光光度計中，記錄540 nm處的吸光度。試管中的PBS用作基線，而“無處理”組用作對照。吸光度值與最佳擬合線相關(guān)聯(lián)，以獲得百分比溶血值。報告獲得的溶血百分比的平均值（平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差）。 凝血化驗 分別測定凝血酶原時間（PT）和活化部分凝血活酶時間（APTT）來評價Ta-MBGs對外源性和內(nèi)源性凝血途徑的影響。 PT測量外源性和共同凝血途徑的活性。它代表在抗凝血液中加入組織因子、磷脂和鈣后形成纖維蛋白凝塊所需的時間。 APTT測量固有和共同coag途徑的活性。 細(xì)胞毒性分析 在牛成纖維細(xì)胞上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)MTT測定以分析Ta-MBG樣品的細(xì)胞毒性（n=6）。成纖維細(xì)胞分離自12-18月齡小牛的掌腕關(guān)節(jié)中央韌帶。結(jié)果與不含Ta-MGB的相同培養(yǎng)物進(jìn)行了比較。 統(tǒng)計分析 所有定量結(jié)果均表示為平均值的平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用單向方差分析和Tukey事后檢驗對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以進(jìn)行后續(xù)的成對比較。顯著性由小于0.05的p值定義。 結(jié)果 Zeta電位 圖1中繪制的測量結(jié)果顯示，所有樣品都顯示出負(fù)ZP。與0Ta樣本相比，0.5Ta的ZP上升至-20.4 mV，但其余樣本下降。 樣本的ZP測量值表示為平均值的平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。所有值均為負(fù)值，一般值隨Ta含量的增加而增加。 溶血試驗 溶血（不需要的紅細(xì)胞溶解）可以通過測量540 nm處的吸光度變化來進(jìn)行光度測定，因為紅細(xì)胞溶解后血漿顯示血紅蛋白水平升高。進(jìn)行該試驗是為了確定Ta-MBGs不必要的溶血。與“未處理”和最重?fù)诫s的鉭-MBG 10Ta相比，大多數(shù)樣品組（0Ta、0.5Ta、1Ta和5Ta）的溶血百分比在統(tǒng)計上顯著降低（圖2）。將Ta含量從5摩爾%增加到10摩爾%會提高溶血百分比。雖然“未處理”和10Ta的溶血百分比相似，但其他樣品減少了不必要的溶解程度 樣品平均值的溶血百分比標(biāo)準(zhǔn)誤差。吸光度值與校準(zhǔn)曲線相關(guān)，得到溶血百分比。*和#分別表示與10Ta和10Ta相比，0Ta、0.5Ta、1Ta和5Ta的溶血百分比降低有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。 凝血化驗 與“未處理”玻璃、1Ta玻璃和10Ta玻璃相比，5Ta玻璃的APTT預(yù)期有統(tǒng)計學(xué)上的顯著降低（圖3（a））。0Ta樣品也與“未治療”相比，顯示出統(tǒng)計學(xué)上顯著的APTT減少（圖3（a））。測試表明5Ta的性能優(yōu)于其他材料（圖3（a））。與0Ta相比，5Ta的PT也出現(xiàn)了意想不到的統(tǒng)計學(xué)顯著降低（圖3（b））。 樣品的APTT (a)和PT (b)結(jié)果。每個標(biāo)記代表一個單獨(dú)的測試；該圖顯示了平均值的平均次數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差。3a.與“未治療”（***p=0.0008）、1Ta（**p=0.005）和10Ta（*p=0.04）組相比，APTT顯著降低（n=7-9，p<0.05）。此外，與“未治療”組相比，0Ta組的APTT水平降低有統(tǒng)計學(xué)意義（n=7-9，p<0.05）。3b.與0Ta組（*p=0.01）相比，5Ta組的PT降低有統(tǒng)計學(xué)意義（n=6-9，p<0.05）。 細(xì)胞毒性分析 MTT法分析Ta-MBGs對牛成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性。獲得的數(shù)據(jù)用于推斷ta- MBGs的Ta摻雜增加（0Ta、0.5Ta、1Ta、5Ta和10Ta之間的比較）和Ta-MBGs質(zhì)量增加（同一組中1、3和5 mg）對細(xì)胞生存力的影響。圖4顯示了溶解的甲晶體在570 nm處的吸光度；晶體吸光度的降低表明成纖維細(xì)胞代謝活性的降低。在樣本組中未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異，這意味著在Si-Ca-P組合物中添加Ta不會影響細(xì)胞活力。 MTT分析。圖顯示了ta-mbg對牛成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性分析。細(xì)胞毒性分析以570 nm處平均（n=6）的平均吸光度標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。差異差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 Ta-MBGs具有止血潛力，因為與未治療相比，它們顯示出高度負(fù)的ZP值、低溶血潛力和降低的APTT。Ta-MBGs存在下的細(xì)胞活力似乎不受Ta含量的影響。通過ZP、APTT和PT測量證實了Ta- MBGs的止血能力，并通過細(xì)胞毒性和溶血分析證明了其安全性。盡管10Ta樣品具有高度陰性的ZP，但它們會引起溶血且不會降低APTT。然而，0Ta和5Ta樣品改善了凝血功能，ZP值為負(fù)，APTT和溶血減少。對于5Ta樣品，由于Si-O網(wǎng)絡(luò)中存在更多的非橋氧，負(fù)ZP有助于激活凝固的內(nèi)在途徑，從而降低APTT。從這些體外試驗?zāi)Ｐ涂梢源_定，5 mol% Ta- MBGs的物理特性是所評估的實驗材料中最有效的止血劑。 |
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