 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 466 | 回復(fù): 0 | |||
我太秀了銅蟲 (小有名氣)
|
[交流]
細(xì)胞系構(gòu)建系列：點(diǎn)突變細(xì)胞系構(gòu)建流程及重點(diǎn)難點(diǎn)
|
|
對(duì)于剛踏入基因編輯領(lǐng)域的小白來說，“基因點(diǎn)突變細(xì)胞系構(gòu)建” 可能聽起來像天書。但其實(shí)，它就像給細(xì)胞的基因 “修 bug”，是研究基因功能、開發(fā)疾病模型的關(guān)鍵技術(shù)。今天，小源就化身基因編輯大師，向你傳授點(diǎn)突變細(xì)胞系構(gòu)建的獨(dú)門秘籍，帶你搞懂它的構(gòu)建流程、常見難點(diǎn)和優(yōu)化妙招，讓你輕松入門。 一、為什么要做基因點(diǎn)突變細(xì)胞系？ 在開始學(xué)習(xí)技術(shù)前，我們得先明白它的價(jià)值 —— 畢竟知道 “為什么學(xué)”，才能更有動(dòng)力。 基因點(diǎn)突變，簡單說就是基因序列中某個(gè)堿基發(fā)生了改變（比如 A 變成 T）。這種微小的變化，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能異常，進(jìn)而引發(fā)疾�。ū热珑牭缎图�(xì)胞貧血癥就是單個(gè)堿基突變導(dǎo)致的）。而基因點(diǎn)突變細(xì)胞系，就是通過技術(shù)手段，在細(xì)胞中精準(zhǔn)制造出這種特定點(diǎn)突變，得到的可穩(wěn)定傳代的細(xì)胞群體。 它的應(yīng)用場景特別廣：比如研究某個(gè)基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致癌癥，用突變細(xì)胞系做實(shí)驗(yàn)比直接用病人組織更可控；開發(fā)新藥時(shí)，用突變細(xì)胞系能快速測(cè)試藥物是否能修復(fù)突變帶來的問題。例如可以通過構(gòu)建肺癌相關(guān)基因突變細(xì)胞系，來篩選出針對(duì)該突變的靶向藥物，為肺癌患者治療帶來新希望。 二、基因點(diǎn)突變細(xì)胞系構(gòu)建流程（小白友好版） 整個(gè)構(gòu)建過程就像 “蓋房子”，從準(zhǔn)備材料到最終驗(yàn)收，每一步都有講究。小源把構(gòu)建流程拆成 4 個(gè)關(guān)鍵步驟，幫你理清思路。 （一）前期準(zhǔn)備：找對(duì) “目標(biāo)”+ 設(shè)計(jì) “工具” 蓋房子前要先確定蓋在哪、用什么材料，構(gòu)建細(xì)胞系也是如此。 1. 選對(duì)目標(biāo)基因：首先要明確你想研究哪個(gè)基因的哪個(gè)位點(diǎn)。比如你想研究 “EGFR 基因 T790M 突變與肺癌耐藥的關(guān)系”，那目標(biāo)就是 EGFR 基因的第 790 位堿基。怎么確定目標(biāo)？通常是查文獻(xiàn) —— 看看其他研究者關(guān)注哪些突變位點(diǎn)，或者根據(jù)疾病數(shù)據(jù)庫（比如 OMIM 數(shù)據(jù)庫）里記錄的致病突變來選擇。 2. 設(shè)計(jì) gRNA：給編輯工具 “導(dǎo)航”：gRNA（向?qū)?RNA）就像 GPS，能帶著基因編輯工具找到目標(biāo)基因位點(diǎn)。設(shè)計(jì)時(shí)要注意兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：一是 “精準(zhǔn)”，要讓 gRNA 剛好結(jié)合在目標(biāo)突變位點(diǎn)附近（一般距離突變位點(diǎn) 10-30 個(gè)堿基），避免找錯(cuò)地方；二是 “特異”，不能和其他基因序列相似，否則會(huì)導(dǎo)致 “脫靶”。 推薦使用免費(fèi)在線工具設(shè)計(jì)，比如 CRISPOR、Benchling、源井紅棉·基因編輯系統(tǒng)，輸入目標(biāo)基因序列，工具會(huì)自動(dòng)推薦合適的 gRNA，并預(yù)測(cè)脫靶風(fēng)險(xiǎn)，非常方便。 （二）選工具：3 種主流編輯技術(shù)怎么挑？ 目前常用的基因編輯工具主要有 3 種：CRISPR-Cas9、ZFNs、TALENs。可以根據(jù)需求選擇適合的基因編輯工具，以下羅列了這3種工具的優(yōu)缺點(diǎn)可供參考： 小源對(duì)于CRISPR-Cas9編輯工具比較熟悉，就以這個(gè)編輯工具為例給大家講解如何利用CRISPR-Cas9構(gòu)建點(diǎn)突變細(xì)胞系。 三）細(xì)胞轉(zhuǎn)染：把 “編輯工具” 送進(jìn)細(xì)胞 選好工具后，要把 gRNA 和 Cas9 蛋白（或其編碼基因）、供體 DNA（包含我們想要的點(diǎn)突變序列）一起送進(jìn)細(xì)胞里 —— 這個(gè)過程叫 “轉(zhuǎn)染”。 常用的轉(zhuǎn)染方法有兩種，可以根據(jù)細(xì)胞類型選擇： 1. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：把編輯工具和脂質(zhì)體混合，形成 “小包裹”，細(xì)胞會(huì)主動(dòng) “吞” 進(jìn)去。優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，不用特殊儀器；缺點(diǎn)是對(duì)有些細(xì)胞（比如懸浮細(xì)胞）效果差。 2. 電轉(zhuǎn)染：用電流在細(xì)胞膜上打 “小孔”，讓編輯工具進(jìn)入細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞都能用；缺點(diǎn)是需要電轉(zhuǎn)儀，而且電流過大可能會(huì)殺死細(xì)胞，需要提前摸索條件。 【小源提示】：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)都是需要提前摸索條件的，轉(zhuǎn)染后別著急下一步，先養(yǎng) 24-48 小時(shí)，讓細(xì)胞恢復(fù)活力，也讓編輯工具在細(xì)胞里發(fā)揮作用。 （四）篩選與鑒定：找出 “成功突變” 的細(xì)胞 轉(zhuǎn)染后，不是所有細(xì)胞都能成功發(fā)生點(diǎn)突變 —— 就像蓋房子，不是每間都合格。我們需要多次篩選鑒定： 1. 初步篩選：用抗生素 “淘汰” 未轉(zhuǎn)染細(xì)胞：在轉(zhuǎn)染時(shí)，我們會(huì)一起導(dǎo)入 “抗生素抗性基因”（比如氨芐青霉素抗性基因）。轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會(huì)帶有這個(gè)基因，能在含抗生素的培養(yǎng)基里存活；沒轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會(huì)被殺死。這樣就能初步篩選出 “可能成功” 的細(xì)胞。 2. 初步鑒定：用測(cè)序確認(rèn)突變：初步篩選后的細(xì)胞，還需要進(jìn)一步確認(rèn)是否真的發(fā)生了目標(biāo)點(diǎn)突變。通過稀釋法將細(xì)胞池細(xì)胞稀釋轉(zhuǎn)移到 96 孔板中，形成單克隆細(xì)胞，對(duì)得到的單克隆細(xì)胞一分為二，并進(jìn)行初檢。鑒定常用的方法是 “PCR + 測(cè)序”：先通過 PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因片段，再把擴(kuò)增后的片段送去測(cè)序，對(duì)比測(cè)序結(jié)果和預(yù)期的突變序列 。 3. 再次鑒定：得到純合子細(xì)胞：擴(kuò)增初檢鑒定正確的單克隆細(xì)胞，再次進(jìn)行大量測(cè)序，以得到預(yù)期的純合子細(xì)胞的DNA測(cè)序。 三、構(gòu)建遇到困難怎么破？ 即使按流程操作，也可能遇到一些問題。小源總結(jié)了 3 個(gè)最常見的難點(diǎn)，幫你提前避坑。 l 難點(diǎn) 1：同源重組效率低 —— 編輯工具 “找不到修復(fù)方向” 基因點(diǎn)突變的關(guān)鍵是 “同源重組”：細(xì)胞會(huì)以供體 DNA 為模板，修復(fù) Cas9 切割后的基因缺口，從而引入點(diǎn)突變。但很多時(shí)候，同源重組效率特別低，導(dǎo)致突變成功率上不去。 原因：一是細(xì)胞周期影響，只有處于 S 期（DNA 復(fù)制期）的細(xì)胞，同源重組活性才高，其他時(shí)期的細(xì)胞很難發(fā)生同源重組；二是細(xì)胞有自己的 “修復(fù)偏好”，更傾向于用 “非同源末端連接”（NHEJ）修復(fù)缺口，而不是同源重組。 l 難點(diǎn) 2：脫靶效應(yīng) —— 編輯工具 “修錯(cuò)了地方” 脫靶效應(yīng)是基因編輯初學(xué)者最擔(dān)心的問題：gRNA 找錯(cuò)了基因位點(diǎn)，導(dǎo)致其他無關(guān)基因發(fā)生突變，后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果就會(huì)受影響，甚至得出錯(cuò)誤結(jié)論。 原因：主要是 gRNA 設(shè)計(jì)不夠特異 —— 如果 gRNA 的序列和其他基因的某個(gè)片段相似，就可能結(jié)合過去，引導(dǎo) Cas9 切割錯(cuò)誤的位點(diǎn)。 l 難點(diǎn) 3：細(xì)胞系 “不配合”—— 不同細(xì)胞 “脾氣” 不一樣 同樣的實(shí)驗(yàn)方案，在 A 細(xì)胞系里能成功，在 B 細(xì)胞系里可能完全不行。 原因：不同細(xì)胞系的 “特性” 差異大：比如有些細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑敏感，一用就死亡；有些細(xì)胞增殖速度慢，篩選鑒定要等很久；還有些細(xì)胞本身的 DNA 修復(fù)能力強(qiáng)，會(huì) “修復(fù)掉” 我們引入的點(diǎn)突變。 四、小白也能用上的 “提效妙招” 針對(duì)上面的難點(diǎn)，我們整理了 3 個(gè)簡單易操作的優(yōu)化方法，新手也能快速上手。 （一）提高同源重組效率：給細(xì)胞 “搭梯子” 1. 讓細(xì)胞同步進(jìn)入 S 期：用藥物（比如胸腺嘧啶核苷TdR）處理細(xì)胞，讓大部分細(xì)胞停留在 S 期，此時(shí)同源重組活性最高。 【小源推薦】：源井生物點(diǎn)突變新技術(shù)——EZ-HRex™，能夠有效調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)轉(zhuǎn)染后更多細(xì)胞進(jìn)入S/G2期。 2. 優(yōu)化供體 DNA 設(shè)計(jì)：供體 DNA 的兩端要包含和目標(biāo)基因同源的序列（叫 “同源臂”），同源臂越長，同源重組效率越高 —— 可以把同源臂長度設(shè)為 600-1000個(gè)堿基，比短同源臂（100-200 個(gè)堿基）效率高 2-3 倍。 3. 加 “增強(qiáng)劑”：在轉(zhuǎn)染時(shí)加入小分子化合物（比如 RS-1），它能激活同源重組相關(guān)的蛋白，提高重組效率。加入之前要先摸索濃度，不應(yīng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。 （二）降低脫靶效應(yīng)：給 gRNA “精準(zhǔn)導(dǎo)航” 1. 嚴(yán)格篩選 gRNA：用在線工具設(shè)計(jì) gRNA 后，一定要看 “脫靶評(píng)分”—— 比如 CRISPOR 會(huì)給每個(gè) gRNA 打脫靶分?jǐn)?shù)，分?jǐn)?shù)越高，脫靶風(fēng)險(xiǎn)越低，盡量要選評(píng)分高的 gRNA。 2. 用 “高保真 Cas9”：普通 Cas9 容易脫靶，而高保真 Cas9（比如 Cas9-HF1、eSpCas9）經(jīng)過改造，對(duì)錯(cuò)誤結(jié)合的 DNA 親和力降低，脫靶風(fēng)險(xiǎn)能降低很多。雖然成本稍高，但能避免后續(xù)實(shí)驗(yàn)出錯(cuò)，很值得。 （三）適應(yīng)細(xì)胞系特性“因材施教” 定方案 1. 選對(duì)轉(zhuǎn)染方法：貼壁細(xì)胞（比如 HEK293T 細(xì)胞）優(yōu)先用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，操作簡單；懸浮細(xì)胞（比如 Jurkat E6.1細(xì)胞）優(yōu)先用電轉(zhuǎn)染，效率更高。如果不確定，可先做 “預(yù)實(shí)驗(yàn)”—— 用兩種方法分別轉(zhuǎn)染，看哪種轉(zhuǎn)染效率高。 2. 調(diào)整篩選時(shí)間：增殖快的細(xì)胞（比如 HeLa 細(xì)胞），轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)就能加抗生素篩選；增殖慢的細(xì)胞（比如原代細(xì)胞），要適當(dāng)延長時(shí)間再篩選，避免細(xì)胞還沒恢復(fù)就被殺死。 3. 用 “單克隆培養(yǎng)”：有些細(xì)胞會(huì)出現(xiàn) “嵌合突變”（部分細(xì)胞發(fā)生突變，部分沒發(fā)生），這時(shí)要做單克隆培養(yǎng) —— 把篩選后的細(xì)胞稀釋，讓每個(gè)孔里只有一個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)成單克隆細(xì)胞群，再鑒定，確保每個(gè)細(xì)胞都帶有目標(biāo)突變。 五、成為 “基因編輯高手”的關(guān)鍵“兩看” （一）核心要點(diǎn)回頭看 前面提到的核心要點(diǎn)可不要忘了，學(xué)到東西就要及時(shí)鞏固，這樣知識(shí)才能真正掌握到自己手上。和小源一起回顧總結(jié)一下： 1. 流程：前期準(zhǔn)備（選基因、設(shè)計(jì) gRNA）→選編輯工具（例如 CRISPR-Cas9）→細(xì)胞轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體 / 電轉(zhuǎn)染）→篩選（抗生素）→鋪單克隆→一分為二→初檢（PCR + 測(cè)序）→擴(kuò)增→復(fù)檢基因型鑒定； 2. 難點(diǎn)：同源重組效率低、脫靶效應(yīng)、細(xì)胞系差異； 3. 優(yōu)化：同步細(xì)胞周期、用高保真 Cas9、因材施教調(diào)方案。 （二）未來發(fā)展向前看 隨著技術(shù)發(fā)展，基因點(diǎn)突變細(xì)胞系構(gòu)建會(huì)越來越簡單：比如 “堿基編輯技術(shù)”（不需要切割 DNA，直接修改堿基）包括單堿基編輯器、先導(dǎo)編輯，能進(jìn)一步降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)；“自動(dòng)化細(xì)胞篩選系統(tǒng)” 能替代人工挑單克隆，提高效率。對(duì)于初學(xué)者來說，未來入門會(huì)更輕松，只要掌握基礎(chǔ)原理，就能借助更先進(jìn)的工具完成實(shí)驗(yàn)。 基因編輯雖然看起來復(fù)雜，但只要一步步拆解，從簡單實(shí)驗(yàn)開始，多總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，很快就能上手。如果你在構(gòu)建點(diǎn)突變細(xì)胞系的過程中遇到困難，除了向有經(jīng)驗(yàn)的科研前輩請(qǐng)教，還可以選擇深耕于基因編輯領(lǐng)域的源井生物作為您科研路上的好幫手。 源井生物可以提供的幫助 源井生物憑借豐富的基因編輯經(jīng)驗(yàn)，在現(xiàn)有成熟技術(shù)體系的基礎(chǔ)上，通過創(chuàng)新性引入 U + 分子完成技術(shù)迭代，成功研發(fā)出 EZ-HRex™技術(shù)。在該技術(shù)的支持下，細(xì)胞基因突變和片段敲入的HDR效率得到全面提升，促進(jìn)轉(zhuǎn)染后更多細(xì)胞進(jìn)入S/G2期，轉(zhuǎn)染后Cell Pool水平的HDR基因型高達(dá)84%。針對(duì)點(diǎn)突變細(xì)胞系構(gòu)建需求，我們進(jìn)一步提供多元化解決方案，涵蓋 RNP 法、先導(dǎo)編輯器、單堿基編輯器及質(zhì)粒抗性法等不同技術(shù)路徑，可根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)場景、效率要求及成本預(yù)算，精準(zhǔn)匹配個(gè)性化需求。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
085600 英一數(shù)二272求調(diào)劑
已經(jīng)有47人回復(fù)
-
材料328求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
085600材料與化工（高分子）290分求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
325求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
320材料與化工，求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
一志愿314求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
347求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
一志愿西交大材料學(xué)碩 346 求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
304分材料專碩求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 我太秀了 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 320材料與化工，求調(diào)劑 +3 | 鶴遨予卿 2026-03-04 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿314求調(diào)劑 +5 | 202111120625 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | Y?l?h 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿西工大材料學(xué)，英一數(shù)二總分321分，求調(diào)劑。 +3 | zz05zz 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料工程269求調(diào)劑 +7 | 白刺玫 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考博] 26申博 求博導(dǎo) +3 | 愛讀書的小帥 2026-02-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)306調(diào)劑 +4 | 26要上岸 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 成績276，專業(yè)代碼0856求調(diào)劑 +7 | 小陳朵 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 化工專碩348，一志愿985求調(diào)劑 +8 | 弗格個(gè) 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)085600 319分 材料與化工 金屬方向 求調(diào)劑 +4 | 青科11 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研]
 計(jì)算機(jī)學(xué)碩 分?jǐn)?shù)285求調(diào)劑
+4
|
glwshine 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +5 | kkcoco25 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研]
材料工程專碩283求調(diào)劑
 5+8
|
，��？ 2026-03-02 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 271求調(diào)劑 +4 | Ricardo1113 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑材料學(xué)碩 +4 | 詞凝Y 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 282求調(diào)劑 +4 | 2103240126 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +10 | 人間唯你是清歡 2026-02-28 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 285求調(diào)劑 +9 | 滿頭大汗的學(xué)生 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +10 | 天下熯 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[論文投稿]
求助coordination chemistry reviews 的寫作模板
10+3
|
ljplijiapeng 2026-02-27 | 4/200 |
|