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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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科研干貨|一文帶您了解石蠟切片的制作步驟與注意事項(xiàng) 已有1人參與
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一、制作石蠟切片的具體步驟 01 取材 從新鮮組織中選取所需部分，用刀片切取合適大小組織塊，組織塊不宜過大。 注意取材時(shí)間不宜拖太久哦，避免組織細(xì)胞中的成分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。 02 固定 ❶固定這一操作步驟能夠快速凝固細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等成分，維持細(xì)胞原有的大小、結(jié)構(gòu)和排列方式。 ❷將組織塊放入容器中，加入 福爾馬林固定液（體積大于組織的 5倍以上倍），密封后室溫放置。小組織固定 3~6 h，大組織需固定 12~24 h，確保組織細(xì)胞形態(tài)凝固、抗原穩(wěn)定。 針對不同的組織類型選擇不同的固定液，如動(dòng)物組織一般使用福爾馬林固定液，植物組織一般使用FAA固定液等。 03 洗滌 組織固定完成后，用流動(dòng)的自來水沖洗30~60 min，以去除多余的固定液。 04 脫水 ❶我們知道在石蠟切片制備的過程中脫水是最關(guān)鍵的步驟，之所以要進(jìn)行脫水處理是因?yàn)槭炇且环N脂溶性物質(zhì)，無法與水混合。組織在經(jīng)過固定后，內(nèi)部其實(shí)還包含大量水分，這就導(dǎo)致導(dǎo)致組織與石蠟無法結(jié)合，后續(xù)的包埋和切片都會(huì)失�。ū热缜衅瑫r(shí)組織易碎裂、脫落）。因此，脫水步驟就基于 “相似相溶” 的特性，通過利用不同濃度的酒精（乙醇）逐步置換組織內(nèi)的水分置換出來，為后續(xù)的透明和浸蠟創(chuàng)造條件。 ❷組織脫水需要使用梯度酒精進(jìn)行處理（逐步去除水分，避免組織收縮變形）。 步驟： 70%乙醇 1 h→80%乙醇 1 h→95%乙醇 1 h→95%乙醇 1 h→100%乙醇 1 h→100%乙醇 1 h 組織越小，脫水時(shí)間越短，各濃度酒精時(shí)間可縮短 30%~50%，例如70% 酒精僅需 30~40 min，避免過度脫水導(dǎo)致組織變脆。如果需要過夜的話，可以停留在70%這一過程中。 特別注意：100% 酒精脫水完成后，需立即將組織移入二甲苯進(jìn)行透明，不能夠長時(shí)間放置在空氣中。暴露在空氣中會(huì)導(dǎo)致組織表面水分重新吸附，或因酒精過度揮發(fā)使組織干裂。 05 透明 組織經(jīng)脫水后，細(xì)胞間隙裝滿的是酒精（水溶性有機(jī)溶劑），石蠟是脂溶性物質(zhì)，無法直接與酒精互溶。透明步驟一般使用二甲苯，其既能與酒精互溶，又能與石蠟互溶，通過置換組織內(nèi)殘留的酒精，使組織逐漸呈現(xiàn)半透明狀態(tài)， 這一過程能去除酒精對石蠟的 “阻隔”，還能讓組織質(zhì)地更均勻，使得后續(xù)石蠟?zāi)軌驖B入組織。 步驟： 醇苯（無水乙醇：二甲苯 =1：1）20 min→二甲苯I 20 min→二甲苯II 20 min 透明時(shí)間不宜過長（組織會(huì)變得堅(jiān)硬且脆），也不宜過短（酒精未除凈會(huì)導(dǎo)致浸蠟不充分），以組織呈半透明為判斷標(biāo)準(zhǔn)。 06 浸蠟 將透明后的組織放入 65℃熔化的石蠟中，浸蠟 2~3 次（每次 1~2 h），讓石蠟完全填充組織間隙，增強(qiáng)硬度。 07 包埋 浸蠟之后就可以進(jìn)行包埋了，用鑷子輕輕夾取組織，放入包埋盒，包埋的時(shí)候利用鑷子對組織位置進(jìn)行調(diào)整，但是如果石蠟?zāi)塘司筒灰{(diào)整了，容易產(chǎn)生氣泡。 08 切片 切片前將蠟塊預(yù)冷，然后將其固定在切片機(jī)上，調(diào)整厚度至 3~6 μm。 先進(jìn)行粗切，這個(gè)過程使得組織部位暴露出來；再進(jìn)行細(xì)切，勻速轉(zhuǎn)動(dòng)手柄切成連續(xù)薄片，用毛筆輕挑切片放入 40~45℃溫水中展平。 09 攤片烤片 用載玻片撈取舒展的切片，放入 65℃烤箱烤片 2 h，使切片牢固貼附，去除殘留水分。 二、石蠟切片制備過程中的注意事項(xiàng) 01 切片上卷，沒法形成連續(xù)蠟帶 ❶切片刀不夠鋒利：可以換新刀片試試。 ❷蠟塊四周留的蠟邊太少：一般留 2 mm左右的石蠟；可以重新包埋蠟塊，或者把蠟塊四周熔化后放進(jìn)包埋框補(bǔ)蠟，修理蠟塊的時(shí)候圍著組織塊弄。 ❸石蠟太硬、黏度不夠：要是蠟塊過硬，能適當(dāng)加點(diǎn)蜂蠟，或者換熔點(diǎn)低的石蠟重新包埋。 02 切片有裂紋 ❶切片刀可能存在小缺口或者刀口不平整的情況。 ❷組織里可能含有較硬的物質(zhì)，比如固定液的結(jié)晶石灰質(zhì)，要是組織中硬性物質(zhì)太多，就不適合使用了。 ❸包埋時(shí)石蠟凍結(jié)得太慢，需要糾正包埋時(shí)的問題。 03 切片厚薄不一致 ❶切片機(jī)的微動(dòng)部分失靈或齒輪跳格 這時(shí)就需要修理切片機(jī)失靈的部分，調(diào)整螺旋，給零件加機(jī)油潤滑；必要時(shí)，得請專業(yè)技術(shù)人員來調(diào)整切片機(jī)。 ❷蠟塊太大、太硬，導(dǎo)致轉(zhuǎn)動(dòng)的時(shí)候刀刃會(huì)受到震動(dòng) 要是蠟塊太大，以后取材的時(shí)候要注意取材的大小。要是蠟塊組織太硬，可以放回水中浸泡，然后再重新脫水和包埋。 石蠟切片 看著還不錯(cuò) |
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陸平2h
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2樓2025-11-06 15:00:24
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