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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
瓊脂糖凝膠電泳的實驗原理及步驟
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在分子生物學(xué)實驗中，瓊脂糖凝膠電泳是一項基礎(chǔ)的技術(shù)， DNA 片段的分離、鑒定， PCR 產(chǎn)物的檢測、質(zhì)粒的提取驗證，都離不開它。很多新手第一次接觸時并不清楚原理，今天這篇文章，就從原理到實操，帶你解析脂糖凝膠電泳。01瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖（Agarose）是從紅藻（如石花菜、江蘺等）中提取的一種天然多糖，瓊脂糖是一種線性多糖分子，當(dāng)它被加熱溶解在如電泳緩沖液中時，分子會均勻分散；待溫度冷卻至 30-40℃時，這些線性分子會通過氫鍵相互連接，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) —— 也就是我們實驗中用到的 “瓊脂糖凝膠”。①凝膠是核酸分子的分離通道凝膠中的孔洞是核酸分子移動的通道，核酸分子需要穿過這些孔洞才能向正極移動；孔洞的大小可以通過調(diào)整瓊脂糖的濃度來控制：濃度越高，分子連接越密集，孔洞越�。粷舛仍降�，分子連接越疏松，孔洞越大。比如分離 50-500bp 的小分子 DNA 時，用 2% 的瓊脂糖凝膠（小孔洞）能讓小分子精準(zhǔn)分離；而分離 1000bp 以上的大分子 DNA 時，用1% 的瓊脂糖凝膠（大孔洞）能避免大分子被 “卡住”，保證分離效率。 ②電場是推動核酸分子移動的動力核酸分子（DNA、RNA）本身帶有負(fù)電荷（因磷酸基團(tuán)解離），在電場中會向帶正電荷的 “正極” 移動。實驗時，我們會將凝膠放入電泳緩沖液中，接通電源后，凝膠兩端形成穩(wěn)定電場，核酸分子就會沿著電場方向移動。③按分子量大小 分離核酸分子在凝膠中移動時，會受到凝膠孔洞的 “阻力”—— 分子量越小的核酸分子，體積越小，越容易穿過凝膠孔洞，移動速度越快；分子量越大的分子，受到的阻力越大，移動速度越慢。經(jīng)過一段時間電泳后，不同分子量的核酸分子會在凝膠中形成 “條帶”：小分子條帶靠近正極，大分子條帶靠近負(fù)極，通過與已知分子量的 “DNA Marker”（標(biāo)準(zhǔn)參照物）對比，就能快速判斷未知核酸片段的大小。 02瓊脂糖凝膠的配置1.稱取瓊脂糖：按所需濃度計算瓊脂糖粉末用量。如：配制 100mL 1% 瓊脂糖凝膠，需稱取 1g 瓊脂糖粉末。2.溶解瓊脂糖：將稱好的瓊脂糖粉末放入錐形瓶中，加入 50mL TAE 緩沖液，輕輕搖勻后，放入微波爐中加熱（中高火，每次加熱 30 秒，取出搖勻，重復(fù) 2-3 次），直到瓊脂糖粉末完全溶解，溶液呈透明無顆粒狀（注意：加熱時錐形瓶需敞口，避免溶液沸騰溢出，取出時要戴手套防燙傷）；3.加入核酸染料：加入適量的核酸染料，如 100mL 溶液加 10μL染料，具體濃度按染料說明書調(diào)整，輕輕顛倒錐形瓶混勻（避免產(chǎn)生氣泡）；4.倒膠與插梳：將電泳槽的膠托洗凈擦干，放入水平臺；將混勻的瓊脂糖溶液緩慢倒入膠托中，避免產(chǎn)生氣泡；然后將梳子垂直插入凝膠一端的凹槽中（梳子齒間距根據(jù)樣品數(shù)量選擇），靜置 30-40 分鐘，待凝膠完全凝固即可使用。使用的時候輕輕將梳子拔出。03跑膠1.準(zhǔn)備樣品：在離心管中按比例混合待檢測樣品與上樣緩沖液（常用 6× 上樣緩沖液，體積比為樣品：上樣緩沖液 = 5:1，如 5μL 樣品加 1μL 上樣緩沖液），輕輕混勻（上樣緩沖液含指示劑，可指示電泳進(jìn)度，還能增加樣品密度，讓樣品沉入梳孔底部）；2.加樣：用移液器吸取混合好的樣品（如 6μL / 孔），將槍頭緩慢伸入梳孔上方，緩慢推注樣品，避免槍頭觸碰凝膠導(dǎo)致梳孔損壞，也避免樣品溢出到相鄰梳孔（每加完一個樣品，更換一次槍頭，防止交叉污染）；3.加 Marker：在其中一個梳孔中加入 5-10μL DNA Marker（作為分子量參照），方便后續(xù)判斷樣品片段大小，一般加在第一個孔中。04電泳1.連接電源：將電泳槽的電極線與電源連接，確保 “凝膠負(fù)極” 接電源負(fù)極，“凝膠正極” 接電源正極（接反會導(dǎo)致核酸向相反方向移動，樣品無法進(jìn)入凝膠）；2.設(shè)定參數(shù)：調(diào)整電壓與時間 —— 常規(guī)分離可設(shè)電壓為 80-120V，時間為 20-40 分鐘（電壓過高會導(dǎo)致凝膠發(fā)熱，樣品條帶模糊；電壓過低則電泳速度慢，分離效率低）；可通過上樣緩沖液中的指示劑（如溴酚藍(lán)）判斷電泳進(jìn)度：溴酚藍(lán)移動到凝膠中間或 2/3 處時，即可停止電泳。05照膠取出凝膠，將凝膠放入凝膠成像儀中，選擇對應(yīng)的激發(fā)光（如紫外光，EB 染料需用紫外光激發(fā)，且操作時需戴紫外防護(hù)手套，避免紫外線傷害），啟動成像儀，調(diào)整曝光時間，直到條帶清晰可見；06結(jié)果分析通過成像圖觀察，若出現(xiàn)清晰的條帶，對比 Marker 的條帶位置，可確定樣品的分子量大�。籇NA Marker/Ladder 由特定分子量的雙鏈DNA 片段組成，已混有含藍(lán)色染料的上樣緩沖液，適用于瓊脂糖凝膠電泳時作為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)。DNA Marker/Ladder 中所有片段均由質(zhì)粒經(jīng)酶切、純化后獲得。 |
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