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ap372767129鐵蟲 (正式寫手)
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[求助]
各位老師，我遇到了一個構(gòu)建ppic9k畢赤酵母表達(dá)載體的問題
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各位老師，有個問題想請教一下。我近期在做將一個目的基因構(gòu)建到ppic9k表達(dá)載體中，用同源重組的方式將目的基因和載體連接起來。但是在轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后，氨芐抗性平板上沒有陽性克隆，有時只長零星的菌落，挑取活化很困難，測序結(jié)果也不對。換了STBL3感受態(tài)轉(zhuǎn)化也不行。這個目的基因能夠正常構(gòu)建到pET系列載體中，并且能夠正常在大腸桿菌中表達(dá)，現(xiàn)在因為課題需要將目的基因構(gòu)建到ppic9k載體中，在轉(zhuǎn)大腸桿菌篩選正確的轉(zhuǎn)化子就一直失敗。之前構(gòu)建其他兩個蛋白的基因到ppic9k載體上，能成功，測序也正常，確定不是操作的問題，也不是載體和目的基因序列錯誤的問題。想問一下，出現(xiàn)這個問題的原因可能是什么，有什么辦法可以解決？我現(xiàn)在想到用同源延伸PCR方法直接獲得有目的基因的線性化載體，這樣可行嗎？ @biostar2009@飛約瘋?cè)嗽?/u>@wizardfan@youlinglyw |
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- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
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這個可以從以下幾個方面解決。 第一是質(zhì)粒ppic9K是不是突變了，如果插入位點是一樣的，可以選擇之前構(gòu)建的2個正確的ppic9K作為出發(fā)質(zhì)粒，重新把片段整合進(jìn)去。 第二個更常見一些， 就是你用的連接酶失活了，導(dǎo)致連接不上，你計算好骨架和片段的摩爾比，重新連接一次，如果還是連接不上，可以直接更換新的連接酶。可以先找人借一次反應(yīng)需要的酶，重新連接一次。 第三個也挺常見的，感受態(tài)失活了，和第二條一樣，你找人借連接酶重新連接后，可以找人再借一只感受態(tài)，和你的感受態(tài)一起轉(zhuǎn)化，看看是不是你的感受態(tài)失活了。 第四個，你提到同源延伸PCR，應(yīng)該說的是gibson組裝�，F(xiàn)在很多公司都在賣一步克隆試劑盒，還有同源重組試劑盒，可以試試看，效果挺好的。只是連接后需要測序驗證，沒有突變。 |
2樓2025-11-25 15:42:56
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