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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
今日科普：電泳marker為什么跑不開
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基本原理核酸電泳是進行核酸研究的重要手段，是分離、鑒定和純化核酸的主要方法。核酸電泳一般有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖作為支持介質(zhì)的一種電泳方法，常用于DNA切膠回收，DNA分離和用于佐證DNA是否重組、質(zhì)粒是否切開等等，因其分離范圍較廣，在實驗室中應(yīng)用廣泛。 而marker跑不開的問題，幾乎每個科研人都踩過坑。這不僅會直接拖延實驗進度，更可能因為無法準確參照分子量，導(dǎo)致后續(xù)結(jié)果判斷失誤。接下來，我們就從關(guān)鍵影響因素入手，拆解對應(yīng)的解決思路 關(guān)鍵影響因素一：瓊脂糖濃度 因素：瓊脂糖濃度是調(diào)控凝膠孔徑大小的核心，濃度越高，凝膠內(nèi)部孔徑越小。對于大分子marker片段（尤其是高分子量markers），過小的孔徑會形成明顯阻礙，導(dǎo)致其遷移速度大幅放緩，最終出現(xiàn)整體跑不動或片段分離效果極差的情況。 解決：需緊扣分子量與濃度的匹配性：小分子量marker（如100-2000 bp）適配1.5%-2%的瓊脂糖濃度；中高分子量marker（如1000-10000 bp）建議用0.8%-1.2%；若涉及超大分子量（如＞10000 bp）的marker，濃度可降至0.5%-0.7%，但要注意此時凝膠強度下降，操作時需小心避免斷裂。 關(guān)鍵影響因素二：電泳緩沖液 因素：電泳緩沖液的狀態(tài)直接影響電泳環(huán)境穩(wěn)定性，是marker正常遷移的重要保障。實際實驗中，緩沖液反復(fù)使用是常見問題，多次使用后，離子濃度會逐漸降低，pH值失衡，直接導(dǎo)致導(dǎo)電性下降，減慢marker遷移速度。此外，緩沖液配制錯誤也時有發(fā)生，比如誤將5×或10×母液直接使用，而非稀釋成1×工作液，濃度不當(dāng)同樣會干擾遷移。 解決：一是保證緩沖液新鮮，建議現(xiàn)配現(xiàn)用，避免多次重復(fù)的使用，TAE或TBE可根據(jù)實驗習(xí)慣選擇；二是嚴格按配方配制，以1×TAE為例，需確保濃度為40mM Tris-乙酸、1mM EDTA，避免濃度偏差引發(fā)問題。 關(guān)鍵影響因素三：電壓與電泳時間 因素：電壓和電泳時間是影響marker遷移效率的兩個關(guān)鍵因素，二者配合不當(dāng)極易導(dǎo)致跑不開。一方面，電壓設(shè)置過低會使marker遷移速度極慢，即使電泳一段時間，也難看到片段分離；另一方面，即便電壓參數(shù)合適，若時間不足，marker片段也無法充分散開，呈現(xiàn)聚集狀態(tài)。 |
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