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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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分子克隆基礎(chǔ)篇4：篩選
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01分子克隆過程中的篩選將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至感受態(tài)細(xì)胞中，根據(jù)相應(yīng)的抗性篩選陽性質(zhì)粒篩選的步驟：a.將質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的感受態(tài)細(xì)胞中b.選擇與重組質(zhì)粒上對應(yīng)抗性基因原核篩選藥物，平板上篩選長出陽性克隆的陽性菌 02什么是感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞是指經(jīng)過特殊處理（如化學(xué)誘導(dǎo)、電穿孔等）后，細(xì)胞膜通透性改變，能夠吸收外界環(huán)境中 DNA 分子（如質(zhì)粒、重組載體）的宿主細(xì)胞（最常用的是大腸桿菌）感受態(tài)細(xì)胞的制備方法：化學(xué)法：最常用鈣離子（Ca²⁺）處理。在低溫下，細(xì)胞處于 0℃的 CaCl₂低滲溶液中，鈣離子會使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成 “感受態(tài)小泡”，同時(shí)降低 DNA 的負(fù)電荷，便于其黏附在細(xì)胞膜表面；后續(xù)通過短暫高溫（如 42℃熱休克）刺激，細(xì)胞膜通透性瞬間增大，外源 DNA 得以進(jìn)入細(xì)胞。物理法：如電穿孔法，通過高壓脈沖電場在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)微孔，讓 DNA 通過微孔進(jìn)入細(xì)胞，效率通常高于化學(xué)法。03轉(zhuǎn)化的步驟1.感受態(tài)細(xì)胞解凍:從 - 80℃冰箱取出感受態(tài)細(xì)胞,迅速放在冰上解凍（約 5~10 分鐘），避免室溫放置導(dǎo)致細(xì)胞失活。 2. 加入外源 DNA:待細(xì)胞完全解凍后，取50μL加入 1~5μL 重組質(zhì)粒 DNA，輕輕混勻冰浴靜置 20分鐘，讓 DNA 充分吸附在細(xì)胞表面。 3. 熱休克處理：將離心管快速轉(zhuǎn)移到 42℃水浴中，放置60S（不同菌株時(shí)間可能略有差異），此步驟通過溫度驟變使細(xì)胞膜通透性瞬間增大，促進(jìn) DNA 進(jìn)入細(xì)胞。 4. 冰浴復(fù)蘇：熱休克后立即將離心管放回冰上，靜置 2~3 分鐘，讓細(xì)胞膜恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。 5. 添加培養(yǎng)基培養(yǎng)：向離心管中加入500μL 無菌 LB 液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃、200rpm 振蕩培養(yǎng) 45~60 分鐘，讓細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)載體上的抗性基因。 6. 涂布平板篩選：3000rpm離心5min，去除上清液，留下100μL左右重懸菌沉淀，均勻涂布在含對應(yīng)抗生素的 LB 固體培養(yǎng)基上，倒置平板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12~16 小時(shí)，直至長出單菌落。 7. 后續(xù)篩選挑取單菌落進(jìn)行后續(xù)鑒定，確認(rèn)陽性克隆。04常用原核篩選抗生素的分類及作用機(jī)制 ①β- 內(nèi)酰胺類（如氨芐青霉素、羧芐青霉素） 作用機(jī)制：抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。 抗性基因原理：質(zhì)粒攜帶AmpR基因，編碼 β- 內(nèi)酰胺酶，可水解抗生素的 β- 內(nèi)酰胺環(huán)，使其失活。 ②氨基糖苷類（如卡那霉素、新霉素）作用機(jī)制：干擾細(xì)菌核糖體功能，抑制蛋白質(zhì)合成。 抗性基因原理：質(zhì)粒攜帶kanR基因，編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，通過磷酸化修飾抗生素使其失去活性。 ③氯霉素作用機(jī)制：結(jié)合細(xì)菌核糖體 50S 亞基，抑制蛋白質(zhì)合成�？剐曰蛟恚嘿|(zhì)粒攜帶CAT基因，編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，通過乙�；揎椏股厥蛊涫Щ睢� ④四環(huán)素類（如四環(huán)素）作用機(jī)制：結(jié)合細(xì)菌核糖體 30S 亞基，阻止蛋白質(zhì)合成。抗性基因原理：四環(huán)素抗性基因tetR編碼膜蛋白，將抗生素泵出細(xì)胞。 05常用原核篩選抗生素的分類及作用機(jī)制真核表達(dá)系統(tǒng)中，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到真核細(xì)胞后，需要使用真核藥物篩選出含有質(zhì)粒的陽性細(xì)胞。 1. 氨基糖苷類衍生物（新霉素、慶大霉素）作用機(jī)制：干擾真核細(xì)胞核糖體（主要是 80S 核糖體）的功能，抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡�？剐曰蛟恚狠d體攜帶細(xì)菌來源的neoR（新霉素抗性基因），編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，通過磷酸化修飾抗生素使其失活。 2. 嘌呤類似物抑制劑（嘌呤霉素）作用機(jī)制：結(jié)構(gòu)類似氨酰 - tRNA，可摻入正在合成的多肽鏈，導(dǎo)致肽鏈合成提前終止，使細(xì)胞無法合成完整蛋白質(zhì)而死亡�？剐曰蛟恚狠d體攜帶puroR基因，編碼嘌呤霉素 N - 乙酰轉(zhuǎn)移酶，通過乙�；揎椏股厥蛊涫Щ�。 3. 糖肽類抗生素（博來霉素）作用機(jī)制：嵌入 DNA 雙鏈，引起 DNA 鏈斷裂，抑制 DNA 復(fù)制和修復(fù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。抗性基因原理：載體攜帶bleR基因，編碼博來霉素結(jié)合蛋白，通過結(jié)合抗生素阻止其與 DNA 作用。 |
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