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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
KO細(xì)胞系構(gòu)建詳細(xì)教程～
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✅基于CRISPR/Cas9的原理，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染cas9/gRNA表達(dá)載體后，cas9-gRNA表達(dá)并切割，此時(shí)細(xì)胞分為四種：轉(zhuǎn)染陰性、轉(zhuǎn)染陽性（未被編輯、被編輯但未成功敲除、成功敲除）；通過抗性可篩選出轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，但不能篩選出成功敲除的細(xì)胞，所以需要通過篩選單克隆得到成功敲除的細(xì)胞～ ✅篩選單克隆的詳細(xì)步驟在圖二 ✅一些小tips 1.一般一個(gè)細(xì)胞一個(gè)片段鋪兩個(gè)96孔板就行，一個(gè)板大概能挑出10來個(gè)單細(xì)胞克隆 2.大概長一周后才能在鏡下找到細(xì)胞，這個(gè)時(shí)候克隆也不大，很好辨認(rèn)是不是單細(xì)胞長出來的，有些孔里會(huì)有2-3個(gè)克隆 3.12孔板轉(zhuǎn)移到6孔板先驗(yàn)證，驗(yàn)證好后成功敲除的細(xì)胞再消化一個(gè)到T25擴(kuò)大培養(yǎng)即可，其它凍存?zhèn)溆?br /> 4.提蛋白時(shí)可以不用BCA定量，不需要內(nèi)參很齊，收樣前鏡下看一下細(xì)胞密度，多的多加點(diǎn)裂解液，少的少加點(diǎn)裂解液，最后結(jié)果看有無，目的條帶沒有就是敲除了～ |
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