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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
WB中ECL常見問題解析與解決方案
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了解過ECL的發(fā)光原理的同學(xué)都知道，即使嚴(yán)格按照流程操作，Western Blot仍可能出現(xiàn)各種"意外"，今天給大家分享ECL檢測中常見問題及解決方案！一、ECL發(fā)光原理回顧ECL化學(xué)發(fā)光基于辣根過氧化物酶（HRP）催化魯米諾（Luminol）與過氧化氫（H2O2）的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生425 nm波長的光子，通過X光膠片或CCD成像系統(tǒng)捕獲信號(hào)。 A液：魯米諾（發(fā)光底物）+ 發(fā)光增強(qiáng)劑B液：過氧化氫（H2O2）+ 穩(wěn)定劑使用時(shí)需1:1混合A/B液，現(xiàn)配現(xiàn)用，避免交叉污染二、ECL常見問題及解決方案 1. 靈敏度降低，曝光時(shí)間延長可能原因：排除樣本表達(dá)和操作的原因有可能是ECL失效/保存不當(dāng)（B液易失效，保存需要注意不要冷凍）導(dǎo)致試劑靈敏度降低。處理建議：更換新的ECL。 2.曝光背景高可能原因：排除樣本表達(dá)和操作的原因可能是不同品牌ECL檢測靈敏度差異導(dǎo)致。高靈敏度ECL會(huì)放大非特異信號(hào)導(dǎo)致背景增高；低靈敏度ECL可能因?yàn)檠娱L曝光時(shí)間導(dǎo)致高背景產(chǎn)生。處理建議：增大/降低上樣量/稀釋倍數(shù)；增強(qiáng)洗滌 注：曝光時(shí)長一致，背景A＞B，是由于靈敏度A＞B導(dǎo)致 3.曝光條帶反白可能原因：①蛋白質(zhì)上樣量過高:當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量過高時(shí)，信號(hào)可能會(huì)過強(qiáng)，導(dǎo)致條帶中間部分泛白。②一抗或二抗?jié)舛冗^高:如果二抗?jié)舛冗^高，HRP過多，底物迅速被消耗，機(jī)器可能無法檢測到底物反應(yīng)的光，因此顯示白色。③曝光時(shí)間過長:曝光時(shí)間設(shè)置不當(dāng)，如過長，會(huì)導(dǎo)致圖像過曝，從而使條帶中間部分呈現(xiàn)白色。處理建議：調(diào)整蛋白質(zhì)上樣量；稀釋一抗和二抗；合理調(diào)整曝光時(shí)間。 4.信號(hào)迅速淬滅/條帶信號(hào)不一致可能原因：目標(biāo)蛋白含量過高HRP或反應(yīng)底物局部耗盡。處理建議：確�？贵w均勻孵育，工作液足量且充分覆蓋膜表面。 |
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