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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
細胞動不動一下就「長滿」！原來是沒有學(xué)會它！
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細胞計數(shù)是細胞培養(yǎng)實驗的一項基本功，遙想當(dāng)年，剛進入實驗室做細胞實驗時，最讓大家頭疼的就是給細胞計數(shù)了，雖然比較簡單，但是經(jīng)常暈頭轉(zhuǎn)向、數(shù)到眼瞎，且一個不小心被其他人打斷了思路，分分鐘前功盡棄。細胞計數(shù)的方法有很多種，最常見也是最直接的方法有血細胞計數(shù)板、電子計數(shù)儀、流式細胞計數(shù)等。還有一些間接判斷細胞數(shù)量的方法，如結(jié)晶紫染色、MTT分析等。 01計數(shù)板準(zhǔn)備 使用雙蒸水或者70%-75%乙醇，將蓋玻片和細胞計數(shù)板進行清潔晾干備用。再將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細胞計數(shù)板上，放在顯微鏡下，觀察計數(shù)格位置是否是潔凈的。 值得注意的是，使用前須保證蓋玻片和計數(shù)板已充分晾干，否則將影響后續(xù)細胞充池及計數(shù)結(jié)果；一般使用乙醇清潔比較多，乙醇可快速揮發(fā)，干燥比較快；如需要擦拭，最好使用擦鏡紙擦拭。 02制備細胞懸液 樣本制備是細胞計數(shù)的第一步，也是至關(guān)重要的一步。細胞的活性和分散程度直接影響計數(shù)結(jié)果，如果細胞懸液制備不當(dāng)，出現(xiàn)細胞團聚或沉淀，就會導(dǎo)致計數(shù)時重復(fù)計數(shù)或漏計，從而使結(jié)果不準(zhǔn)確。例如在制備腫瘤細胞懸液時，需要使用適當(dāng)?shù)南笇⒓毎麖慕M織塊中分離出來，消化時間過長或過短都會影響細胞的活性和分散效果。消化時間過長，細胞會被過度消化，導(dǎo)致細胞膜破損，細胞死亡；消化時間過短，細胞則無法充分分離，容易形成團塊。 對于貼壁生長的細胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細胞從培養(yǎng)皿表面脫落，并加入適當(dāng)?shù)暮迮囵B(yǎng)基，中和胰酶的作用并重懸細胞，以得到均質(zhì)的細胞懸液。并稀釋到合適的倍數(shù)。如果需要計算細胞的活率，則需要將細胞懸液和0.4%臺盼藍等體積混合;室溫孵育3~5分鐘，使臺盼蘭完全進入死細胞，使死細胞著藍色(注: 懸浮細胞染色時間可視情況適當(dāng)延長)。 03血細胞計數(shù)板加樣 充池是將細胞懸液引入計數(shù)板計數(shù)區(qū)域的過程。這一步驟要求操作輕柔、迅速，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡的存在會占據(jù)計數(shù)區(qū)域的空間，干擾細胞的觀察和計數(shù)。同時，充池后要等待細胞沉降一段時間，使細胞均勻分布在計數(shù)區(qū)域內(nèi)，再進行計數(shù)，如果過早計數(shù)，細胞可能還未完全沉降，會導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果偏低；如果等待時間過長，細胞可能會因干燥或死亡而影響計數(shù)準(zhǔn)確性。 值得注意的是，若需進行多個樣品的計數(shù)，應(yīng)盡量保證每次充池的體積一致一般在10 μL/池左右，如果計數(shù)數(shù)內(nèi)未充滿細胞，或者過多都將影響計數(shù)結(jié)果；操作時，蓋玻片下不能有氣泡，也不能使細胞懸液流入另一個樣品池中，否則需要重新清洗計數(shù)板重新加樣計數(shù)。 04 細胞計數(shù) 在顯微鏡下觀察細胞時，要選擇合適的放大倍數(shù)和光線強度，以確保能夠清晰地看到細胞。計數(shù)時，要遵循一定的計數(shù)規(guī)則，如“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”，避免重復(fù)計數(shù)或漏計。此外，對于形態(tài)不規(guī)則或難以辨認的細胞，要結(jié)合細胞的特征和經(jīng)驗進行準(zhǔn)確判斷。例如在計數(shù)白細胞時，要根據(jù)細胞的核形態(tài)和細胞質(zhì)的特點區(qū)分不同類型的白細胞，如中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞等。 05細胞濃度計算 由下圖可以得出，每個大方格的容積為: 1mm2 × 0.1mm=0.1mm3=10-4cm3= 10-4mL，在常規(guī)沒有使用臺盼藍染色時，可以以下面公式計算每毫升樣品中細胞的個數(shù): 每毫升樣品中細胞的個數(shù)=每個大方格內(nèi)細胞的平均數(shù) x細胞稀釋倍數(shù)x104。 06影響細胞計數(shù)結(jié)果的因素 1. 細胞類型與狀態(tài)不同類型的細胞具有不同的形態(tài)和大小，其計數(shù)方法也可能有所差異。例如紅細胞體積較小，數(shù)量眾多，計數(shù)時需要采用特定的稀釋倍數(shù)和計數(shù)方法；而白細胞體積較大，數(shù)量相對較少，計數(shù)時需要更加仔細地觀察和區(qū)分。此外，細胞的生長狀態(tài)也會影響計數(shù)結(jié)果。處于對數(shù)生長期的細胞活性高、分散性好，計數(shù)結(jié)果相對準(zhǔn)確；而處于衰老期或凋亡期的細胞則容易出現(xiàn)團聚或變形，影響計數(shù)準(zhǔn)確性。2. 環(huán)境因素環(huán)境溫度、濕度和pH值等因素也會對細胞計數(shù)產(chǎn)生影響。溫度過高或過低會影響細胞的活性和代謝，導(dǎo)致細胞死亡或變形；濕度過低會使細胞懸液蒸發(fā)，導(dǎo)致細胞濃度升高；pH值的變化會影響細胞的電荷分布和分散狀態(tài)，從而影響計數(shù)結(jié)果。因此，在進行細胞計數(shù)時，要盡量保持環(huán)境條件的穩(wěn)定，為細胞提供一個適宜的生存環(huán)境。 |
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