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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
Coip實驗protocol 和tips，以及如何避免IgG過濃而掩蓋趨勢
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收集細胞+裂解細胞(這兩步驟內源和外源co-ip一樣操作)-.做co-ip的細胞量:原則:細胞量不宜少，一般是一個10cm皿的細胞量起步，懸浮細胞1000~3000萬都可以，貼壁細胞大概一整盤10cm皿貼滿皿底的量，若貼壁細胞一顆比較大，建議用兩盤去做ip。 二，裂解細胞: 首先:500-1亦00rpm*5min離心去掉上清培養(yǎng)基，PBS重懸洗一遍。(1mIPBS)。PBS預冷，在冰上或者4度放置。 其次:裂解細胞懸浮細胞嗐:細胞收集到EP管內，加適量IPBuffer裂解液(10cm大皿的細胞量可加1m裂解液)，吹勻細胞冰上裂解30-60min，每隔10min上下顛倒4-5次防止細胞沉淀無法 裂解。 貼壁細胞:可用ipbuffe直接冰上刮細胞，也可采取懸浮細胞的方法，從而達到裂解的效澕捕盤右外屏銖洳夀沅啖 最后鑹險摜堊鯔鏵裂解訉奪潯徵杖者畢后，4度離心機12000rpm*20min離心，取上清蛋白放置新的EP管中。 !注意事項: 1、用IP Buffer裂解液。(自配or成品) (用于裂解細胞的IP Buffer要加防止蛋白降解的抑制劑，抑酶，亮素，PMSF等重點是:一定要加!) 2、做ip的裂解液比較溫和，是為了防止破壞蛋白結合，因此不宜超聲，只可冰上裂解。 3、裂解液因溫和，裂解效果相對不那么充分，因此用較多的細胞，較多的裂解液。般1個10cm皿的細胞量+1ml裂解液。懸浮細胞大概采用2000萬，貼壁就是一個10cm滿皿的量。 (自配裂解液:冰上裂解，10min一次上下?lián)u勻，裂1~2個小時都是可以的，裂解時間久點，更充分。 (成品裂解液:冰上裂解15-20min即可，不同品牌有差別，例如ACE的buffer是15min) 4淜囑直付裂Ⓤ現(xiàn)解完賧投細臒唝醬胞以后4度離心12000rpm離心30min，離心完會發(fā)現(xiàn)還有部分細胞沒裂解沉底了，是正�，F(xiàn)象，吸取上清到新的管子里，準備加一抗or納米beads。 Coip蛋白樣品制作 加抗體: 分為兩種情況: 第一種:ip目的蛋白，則采用一抗和beads分開的產品。加一抗孵育過夜: 這里有個重要的問題是蛋白定量，需不需要定量看實驗目的，若要定量，蛋白定量之后再加一抗。1.如果只做一組，單純的定性實驗，也就是看二者之間有沒有結合，無需定量。2.如果做多組，經過處理(例如:加藥，轉染等)后看二者之間的結合有沒有變多或者減少，那就要定量。定量原則:保證被ip的蛋白量基本一致，一般3~4mg左右就足夠了，最起碼2mg，保證每組都這個量，被ip的蛋白才會基本保持一致，才能看趨勢。過夜以后加beads: 瓊脂糖proteinA+G，加40ul，加珠子時，把槍頭剪個口，以防掛壁太多，盡可能加準加了beads以后4度搖3~4小時，然后洗珠子。(不同品牌不一樣，根據(jù)自己使用的beads使用量做即可) 第二種:ip標簽蛋白，則采用帶一抗的beads 四，洗beads:敲重點:洗珠子一定要懸空加洗液進入EP管，不要吹打!!!(磁力架也可)beads很輕，懸空加，借洗液沖力吹起珠子，達到洗滌目的。washingbuffer可以用的未加抑制劑的ipbuffer，也可以用pbs洗，每次用1ml去洗。離心或鏌濫瑩騍韁博者用凵磁錚糇錨力架，看自己實驗室習慣，4500rpm離心3min，洗5次，最后空用一遍，空甩完把剩余的洗滌液盡可能吸干凈，只留besds，但是不要吸到besds，殘留一點沒關系。 五，加loading:洗完beads后加和beads量一樣的2*loading。例如beads加40u，loading也加40ul。加了以后用10u小槍頭輕輕攪拌，不要吸，只攪拌，攪拌的loading和beads充分融合緊接著去煮，100度煮5min，蛋白樣品制作完成。 避免IgG過濃的小技巧總結 1、異源抗體的使用(可部分避免);舉例:鼠抗做ip，免抗做wb。 2、無IgG二抗的使用(可部分避免):可采用去除輕重鏈的二抗孵育，而不是普通二抗。3、外源性coip，納米抗體的使用(偶聯(lián)抗體和beads，且去除IgG);4、外源性coip，質粒盡可能帶標簽(例如Flag);標簽很容易putdown下來，可一定程度增強豐度，不被IgG掩蓋5、洗beads可多洗幾次，5次起，可增加到6-8次;6、加一抗需要注意的點: 抗體濃度;IgG，標簽抗體，目的蛋白抗體原管濃度都是不一致的，一般情況下都是IgG濃度最高，其次標簽，目的蛋白抗體濃度最低。蛋白豐度:細胞內IgG含量遠遠高于目的蛋白 因此，加一抗時不要等體積添加，注意按一抗質量添加。也就是說，，一般情況下，IgG一抗的使用量要比目的蛋白少很多倍，具體情況具體分析! 7、保證使用目的蛋白可以輕松put down的使用量，使用較為好用的一抗去putdown目的蛋白。 |
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