 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 930 | 回復: 0 | |||
畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
|
[交流]
PCR提取超詳細攻略✨
|
|
做分子生物學實驗，PCR提取可是基礎中的基礎！PCR提取的全過程，從原理到操作，手把手教你搞定實驗，讓目標DNA片段輕松擴增。 1️⃣ PCR原理：DNA的“復制機” PCR，全稱聚合酶鏈式反應，是一種在體外快速擴增特定DNA片段的“黑科技”。它的原理其實很簡單，就像給DNA分子按了個“復制”按鈕。具體來說，PCR利用了DNA的熱變性（高溫下雙鏈解開成單鏈）和復性（降溫后單鏈重新結(jié)合）特性，再加上DNA聚合酶的“搭把手”，就能實現(xiàn)目標DNA片段的指數(shù)級擴增啦。 PCR過程主要分三步：變性、退火和延伸。變性是把DNA雙鏈“掰開”，退火是讓引物和單鏈DNA結(jié)合，延伸就是DNA聚合酶按照模板合成新的DNA鏈。這三個步驟組成一個循環(huán)，重復多次，目標DNA片段就能像滾雪球一樣越擴越多啦。 2️⃣ PCR提取的關鍵步驟：從樣本到純凈模板 ① 核酸提取的必要性 在做PCR之前，必須從復雜的生物樣本（比如血液、組織、細胞等）里提取出純凈的核酸（DNA或RNA）。因為樣本里不僅有核酸，還有蛋白質(zhì)、脂類、多糖、核酸酶等各種雜質(zhì)。這些雜質(zhì)可能會干擾PCR反應，甚至把核酸“吃掉”，所以提取純凈的核酸是成功的關鍵第一步。 ② 核酸提取的常見方法 傳統(tǒng)方法：酚-氯仿抽提法 原理是用裂解液破壞細胞釋放核酸，再用酚-氯仿去除蛋白質(zhì)，最后用乙醇沉淀DNA。優(yōu)點是核酸純度高，能同時分離DNA和RNA。但缺點也很明顯，操作繁瑣，用到的苯酚、氯仿有毒，RNA還容易被降解，對操作要求極高。 柱式提取法 原理是核酸在高鹽條件下能特異性結(jié)合硅膠膜，而雜質(zhì)不結(jié)合。通過離心把雜質(zhì)洗掉，最后用低鹽緩沖液把核酸洗脫下來。這種方法操作簡便快速，純度高，適合PCR、qPCR等下游應用，而且安全，不使用有毒試劑。 磁珠法 原理是利用表面修飾的磁性微珠和核酸結(jié)合，通過磁場分離核酸和雜質(zhì)，最后洗脫核酸。磁珠法的優(yōu)點是高通量、自動化兼容性強，適合大規(guī)模樣本處理，而且純度好，適合高靈敏度檢測。 ③ 核酸提取的常見步驟（以柱式法為例） 樣本處理：采集樣本（比如血液、咽拭子、組織等）。 裂解：用裂解液和蛋白酶K破壞細胞或病毒，釋放核酸。 結(jié)合：加入乙醇后，把混合物加載到核酸純化柱，核酸結(jié)合到硅膠膜上。 洗滌：用洗滌緩沖液去除蛋白質(zhì)、鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)。 洗脫：用低鹽緩沖液（比如ddH₂O或TE）洗脫核酸，得到純凈的DNA/RNA。 3️⃣ PCR提取過程中的注意事項 避免污染：核酸提取過程中要嚴格控制操作條件，避免外源DNA污染。比如，使用無核酸酶的試劑和耗材，操作時戴手套、口罩，避免說話、咳嗽。 保證核酸完整性：提取過程中要注意避免核酸降解。比如，提取RNA時要避免RNase污染，操作要輕柔，避免劇烈震蕩。 優(yōu)化提取條件：根據(jù)樣本類型和實驗需求，選擇合適的提取方法和條件。比如，對于低DNA含量的樣本，磁珠法的回收率更高。 4️⃣ 磁珠法 vs 柱式提取法：怎么選？ 自動化與高通量：磁珠法高度自動化，適合大規(guī)模樣本處理；柱式提取法操作簡便，但難以完全自動化。 操作簡便性：磁珠法操作簡單，無需離心等復雜步驟；柱式提取法需要多次離心，操作相對繁瑣。 核酸質(zhì)量與產(chǎn)量：磁珠法核酸純度高，得率穩(wěn)定；柱式提取法對于低DNA濃度樣本回收率可能較低。 適用性：磁珠法適用范圍廣，可處理多種復雜樣本；柱式提取法更適合常規(guī)樣本。 成本與經(jīng)濟性：磁珠法試劑成本較高，但單次使用量少，整體成本可控；柱式提取法單次成本相對較高。 學習曲線：磁珠法學習曲線平緩，減少了對操作人員的培訓需求；柱式提取法學習曲線較陡峭，需要大量手動移液。 安全性：磁珠法整個提取過程不涉及有毒試劑，更加安全環(huán)保；柱式提取法雖不使用有毒試劑，但柱子成本略高。 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務內(nèi)容：分子生物學、免疫, 重組蛋白及ELISA相關、活性小分子化合物、高端化學、材料化學、細胞資源庫與培養(yǎng)相關、生命科學、天然產(chǎn)物 |
回復此樓» 猜你喜歡
歡迎211本科同學，過A區(qū)國家線，A區(qū)非偏遠一本，交叉學科課題組
已經(jīng)有12人回復
-
成果系統(tǒng)訪問量大，請15分鐘后再嘗試。由此給您造成的不便，敬請諒解。
已經(jīng)有14人回復
-
281電子信息求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復
-
材料277分求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復
-
求調(diào)劑院校
已經(jīng)有12人回復
-
293求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
化學 0703求調(diào)劑 總分293 一志愿211
已經(jīng)有10人回復
-
320材料一志愿西工大專碩英二數(shù)二 有兩年光伏工作經(jīng)驗
已經(jīng)有7人回復
-
材料328求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復
-
304分材料專碩求調(diào)劑
已經(jīng)有12人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 畢合生物2024 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料復試調(diào)劑 +7 | 學材料的點 2026-03-01 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +8 | 一個學習者 2026-03-04 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 282求調(diào)劑 +5 | 2103240126 2026-03-02 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 學碩材料275調(diào)劑 +9 | 路三三 2026-03-03 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 武理材料工程302調(diào)劑 +3 | Doleres 2026-03-03 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料專碩290求調(diào)劑 +3 | 杰尼龜aaa 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600求調(diào)劑 +4 | LRZZZZZZ 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +4 | 是樂渝哇 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考博] 26申博 求博導 +3 | 愛讀書的小帥 2026-02-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 266材料化工求調(diào)劑 +3 | 哇塞王帥 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 江蘇省農(nóng)科院招調(diào)劑1名 +5 | Qwertyuop 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[碩博家園] 2025屆雙非化工碩士畢業(yè)，申博 +4 | 更多的是 2026-02-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +10 | 人間唯你是清歡 2026-02-28 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 材料工程274求調(diào)劑 +5 | Lilithan 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料085601調(diào)劑 +5 | 多多子. 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿中石油（華東）本科齊魯工業(yè)大學 +3 | 石能偉 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +3 | 恒順自然 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 264求調(diào)劑 +4 | 巴拉巴拉根556 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[碩博家園] 博士自薦 +7 | 科研狗111 2026-02-26 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +9 | 南迦720 2026-02-28 | 10/500 |
|