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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
WB實驗新手指南:如何選擇合適的內參
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Western blot實驗，與RT-qPCR實驗一樣，都是用來探究基因表達情況的，不過它們關注的層面不同。RT-qPCR是在RNA水平上看基因是怎么表達的，而Western blot則是在蛋白質層面上進行探究。在進行Western blot實驗時，我們需要找到一個在大多數(shù)情況下表達都相對穩(wěn)定的基因，這個基因就是內參基因。它就像一個“標尺”，讓我們能夠更準確地衡量其他基因（也就是我們的目的基因）的表達情況。 當我們想要知道某個實驗處理對目的基因表達有什么影響時，就會用到這個“標尺”。我們先挑選出適合的內參基因，然后在實驗組和對照組中分別檢測它和目的基因的表達量。通過比較這兩組數(shù)據(jù)中目的基因相對于內參基因的表達量，我們就能看出實驗處理對目的基因表達產生了怎樣的影響。 一.什么是內參基因 內參基因：也被稱為管家基因或持家基因，是生物體或細胞中持續(xù)并穩(wěn)定表達的基因。這些基因編碼的產物是維持細胞基本生命活動所必需的。 內參基因的特點： ⚫穩(wěn)定性：內參蛋白的表達水平在不同實驗條件、細胞類型和組織中保持相對穩(wěn)定，這是其作為內參的基礎。 ⚫普遍性：內參蛋白廣泛存在于多種組織和細胞中，便于在各種實驗中使用。 ⚫易檢測性：內參蛋白通常具有較高的表達量，易于檢測內參的作用：1. 標準化樣品上樣量內參蛋白是細胞中穩(wěn)定表達且量相對恒定的蛋白質。通過檢測內參蛋白，可以確保每個樣品的蛋白質上樣量是一致的，避免因樣品上樣量差異導致的結果誤差。 2. 校正實驗誤差在Western Blot實驗過程中，從樣品制備、蛋白質提取、電泳到轉膜等多個步驟中可能會引入技術誤差。內參蛋白的信號可以用來校正這些步驟中可能出現(xiàn)的變動，確保實驗結果的可靠性。 3. 數(shù)據(jù)定量分析在進行目標蛋白的定量分析時，通常會將目標蛋白的信號強度與內參蛋白的信號強度進行比值計算。這種比值計算方法能夠更準確地反映目標蛋白在不同樣品中的相對表達水平，排除由于實驗條件和處理不同導致的變化。 如何選擇合適的內參？ 一.針對樣本而言：在選擇內參蛋白時，我們首先需要考慮樣品的物種來源以及目的蛋白的表達部位，如全細胞、細胞核、細胞質、細胞膜或血清、血漿樣本等。 🔷全細胞：常用的內參蛋白包括GAPDH、β-肌動蛋白（β-actin）和β-微管蛋白（β-tubulin）。這些蛋白在大多數(shù)哺乳動物細胞中表達穩(wěn)定，且分子量適中，易于檢測。🔷細胞核：對于核蛋白的研究，可以選擇Histone H3和Lamin等作為內參。Histone H3是核蛋白的重要組成部分，而Lamin則與核膜的穩(wěn)定性有關。🔷細胞膜：針對細胞膜蛋白的研究，ATP1A1是一個合適的選擇。它是細胞膜上的重要離子泵，表達穩(wěn)定。🔷線粒體：對于線粒體蛋白的研究，可以選擇VDAC1作為內參。VDAC1是線粒體外膜上的一種重要蛋白質，分子量約為30kDa。🔷血漿樣本：由于這些樣本沒有完整的細胞結構，可以選擇Albumin（白蛋白）作為內參。它是血清和血漿中最豐富的蛋白質之一，表達穩(wěn)定。 二.根據(jù)蛋白量選擇 根據(jù)目的蛋白的大小，考慮合適的內參蛋白，一般目的蛋白和內參蛋白的分子量相差5kD以上。但是也并不是內參蛋白和目的蛋白的大小相差越大越好的，需要考慮轉膜時間等 三.考慮目的蛋白的表達部位 在蛋白質提取的研究中，有時候會選擇分別提取細胞的胞漿（細胞質）和胞核中的蛋白質，而不是提取整個細胞的總蛋白。這樣做的好處是可以更精確地研究特定部位（胞漿或胞核）的蛋白質功能。 β-actin是一種在胞漿中高效且穩(wěn)定表達的蛋白質，由于總蛋白中胞漿蛋白占比較大，因此β-actin常被用作總蛋白研究中的內參蛋白。然而，由于β-actin主要在胞漿中表達，在細胞核內幾乎不表達，因此它不能作為胞核蛋白研究的內參。對于胞核蛋白的研究，會選擇那些在胞核中特異性表達的蛋白質作為內參，比如PCNA和Histone H3等。 同樣地，如前描述的對于其他細胞部位（如核膜、線粒體）的蛋白質研究，也需要選擇相應部位特異性表達的蛋白質作為內參。例如，Lamin B可以作為核膜蛋白研究的內參，而COXIV和VDAC1則可以作為線粒體蛋白研究的內參。 |
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