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我太秀了銅蟲(chóng) (小有名氣)
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HEI-OC1細(xì)胞培養(yǎng)和基因編輯小技巧
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HEI-OC1細(xì)胞是一種來(lái)源于小鼠耳蝸毛細(xì)胞的常用細(xì)胞模型，在聽(tīng)力相關(guān)的基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛。過(guò)去幾十年間，它逐漸成為探討毛細(xì)胞功能及其病理機(jī)制的重要工具，尤其在耳毒性篩藥、聽(tīng)力損傷機(jī)制解析及聽(tīng)覺(jué)保護(hù)策略的研究中發(fā)揮著顯著作用。該細(xì)胞系具備多個(gè)實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)，例如較強(qiáng)的增殖能力、穩(wěn)定表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志蛋白，以及對(duì)轉(zhuǎn)染操作的良好響應(yīng)——這些特性使其在模擬內(nèi)耳毛細(xì)胞生理狀態(tài)方面具備較高的參考價(jià)值。 目前，HEI-OC1細(xì)胞廣泛應(yīng)用于耳科學(xué)研究、高通量藥物篩選以及新型基因治療策略的前期探索。對(duì)于從事聽(tīng)覺(jué)生物學(xué)研究的科研人員而言，它幾乎已經(jīng)是“標(biāo)配”模型。本文將簡(jiǎn)要回顧其來(lái)源、特性及常見(jiàn)應(yīng)用，幫助讀者更好地理解這一細(xì)胞模型在現(xiàn)代聽(tīng)覺(jué)研究中的角色與價(jià)值。 細(xì)胞信息： 細(xì)胞名稱：HEI-OC1（小鼠耳蝸毛細(xì)胞系） 細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)條件：90%DMEM+10%FBS 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5% 溫度：37℃ 換液頻次：2-3天/次 傳代比例：1:3-1:5 注意：該細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)時(shí)的溫度敏感，37℃是標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)條件處于33℃時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)快速增值和去分化現(xiàn)象；當(dāng)生長(zhǎng)條件是39℃時(shí)，高溫會(huì)抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)分化現(xiàn)象 細(xì)胞生長(zhǎng)正常圖片：通常呈典型多邊形上皮樣形態(tài)，細(xì)胞邊界清晰，呈現(xiàn)典型的鋪路石樣緊密排列，單層生長(zhǎng)不重疊 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差圖片：細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞邊緣模糊，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，折光性變低 1.細(xì)胞復(fù)蘇 1)準(zhǔn)備：取7mL完全培養(yǎng)基于離心管中備用 2)解凍：將細(xì)胞從干冰里取出，用鑷子夾住蓋子放入 37℃水浴中快速晃動(dòng)（注意：水不能沒(méi)過(guò)蓋子），使其在1分鐘左右完全融化，直至冰塊融化至綠豆大小，停止水浴 3)離心：將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1100rpm條件下離心4分鐘，棄去上清液 4)重懸與接種：用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于合適大小的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中 5)培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)及貼壁情況 細(xì)胞傳代（以T25瓶為例）： 1)當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80%時(shí)可進(jìn)行傳代，傳代時(shí)在超凈臺(tái)內(nèi)棄去培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液，加入5mLPBS洗滌細(xì)胞1-2次 2)加入1mL胰酶，輕輕晃動(dòng)瓶子并使胰酶完全浸過(guò)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱孵育 1-2分鐘，待在顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞變圓變亮，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶?jī)蓚?cè)有大部分細(xì)胞脫落時(shí)，立即終止消化 3)加入2倍胰酶體積即2mL完全培養(yǎng)基終止消化，然后轉(zhuǎn)移至15mL離心管中 4)1100 rpm 室溫離心 4 分鐘，離心結(jié)束，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞 5)細(xì)胞按照1:3-1:5比例傳代，傳代第二天觀察細(xì)胞狀態(tài) 細(xì)胞凍存： 1)收集細(xì)胞：按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中 2)離心：1100rpm條件下離心4分鐘，去掉上清 3)重懸與凍存：用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1mL凍存液含1×10^6個(gè)細(xì)胞/mL分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息 4)降溫與儲(chǔ)存：將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮罐內(nèi)保存 細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)： 1.培養(yǎng)基和血清：確保使用正確的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和加入適量血清，配好的完全培養(yǎng)基需4℃保存，建議2周內(nèi)使用完畢 2.細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境：培養(yǎng)溫度控制在37℃（嚴(yán)格恒定，±0.5℃ 波動(dòng)）、濕度≥90%（培養(yǎng)箱內(nèi)放置無(wú)菌水盤(pán)）、CO₂ 濃度：5% 3.傳代時(shí)機(jī):匯合度 70-80% 時(shí)傳代（超過(guò) 90% 易自發(fā)分化），通常每2-3天傳代一次 4.細(xì)胞傳代操作：細(xì)胞傳代時(shí)，注意消化時(shí)間和胰酶濃度，避免因消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短導(dǎo)致的細(xì)胞損傷 5.凍存?zhèn)浞荩航ㄗh保留不同代次的凍存?zhèn)浞�；該�?xì)胞系傳代超過(guò)30代后可能出現(xiàn)特性改變，建議建立主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù) HEI-OC1細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)注意事項(xiàng)： 1.確保細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞活性高，分裂旺盛，有利于轉(zhuǎn)染效率的提升，細(xì)胞密度一般在70-80%之間 2.注意細(xì)胞消化時(shí)間，避免過(guò)度消化，對(duì)細(xì)胞造成傷害 3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞要吹打成單細(xì)胞，避免細(xì)胞聚團(tuán) 4.細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)活率≥90% 5.對(duì)于轉(zhuǎn)染試劑使用前需要充分混勻保證其均勻性 6.建議進(jìn)行藥篩預(yù)實(shí)驗(yàn)找到最佳藥篩濃度，以便于轉(zhuǎn)染后進(jìn)行藥篩 7.電轉(zhuǎn)法： (1)電轉(zhuǎn)時(shí)需控制好細(xì)胞量，電轉(zhuǎn)后根據(jù)細(xì)胞量接種到合適的培養(yǎng)板里 (2)需保證電轉(zhuǎn)后細(xì)胞貼壁率≥70% (3)需控制好實(shí)驗(yàn)時(shí)間，電轉(zhuǎn)全程不宜過(guò)長(zhǎng) 8.慢病毒法： (1)進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)找到最合適的MOI (2)感染病毒前細(xì)胞匯合度控制在30-40%之間，不可過(guò)高 (3)感染前添加助染劑Polybrene 9.脂質(zhì)體法： (1)選擇適合HEI-OC1細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳轉(zhuǎn)染條件 (2)轉(zhuǎn)染前24h進(jìn)行細(xì)胞鋪板，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合度控制在60-70% HEI-OC1鋪單克隆實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)： 1.確保鋪克隆實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞狀態(tài)正常，使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行鋪克隆，鋪克隆前細(xì)胞匯合度建議控制在70%左右 2.提前預(yù)溫所有試劑（培養(yǎng)基、胰酶、PBS） 3.鋪克隆時(shí)細(xì)胞活率≥85% 4.可先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)找到合適的鋪克隆梯度，避免單克隆占比太低 5.細(xì)胞接種96孔板時(shí)需確保細(xì)胞分布均勻 6.使用“有限稀釋法”進(jìn)行鋪克隆，稀釋細(xì)胞計(jì)數(shù)后結(jié)果最好落在1*10^6-2*10^6之間 |
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