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夏末～易科新蟲(chóng) (小有名氣)
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慢病毒實(shí)驗(yàn)步驟
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慢病毒實(shí)驗(yàn)步驟 以六孔板中的1孔為例，每個(gè)樣品需要1x106個(gè)293T細(xì)胞。 1.取1.5ml滅菌EP管，加入1.5ug包裝混合質(zhì)粒和0.5ug表達(dá)質(zhì)粒以及250ul的無(wú)血清培養(yǎng)基。輕柔混勻，室溫孵育 5min。 2.取1.5ml滅菌EP管，取9ul 脂質(zhì)體20001溶于250ul無(wú)血清培養(yǎng)基中。輕柔混勻室溫孵育5min。 3.將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻室溫孵育20min 4.用胰酶消化并記數(shù)293T細(xì)胞。用含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。 5.在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，再加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物， 6.將1ml重懸的293T細(xì)胞(1x106個(gè)細(xì)胞/ml)加入到平板中。37℃℃CO2孵箱中孵育過(guò)夜。 7.移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基移除，代之以DMEM(含丙酮酸鈉和非必須氨基酸) 8.轉(zhuǎn)染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min，去除沉淀， 9.病毒上清-80℃貯存。包裝出來(lái)的慢病毒對(duì)NIH/3T3細(xì)胞達(dá)90%以上感染效率。 注意事項(xiàng)： 1.慢病毒理論上可以包裝5~7Kbp的片段，但過(guò)大的片段包裝會(huì)影響病毒的出毒效率，導(dǎo)致獲得的病毒度較低，影響病毒感染效果。因此一般建議最好將包裝的片段控制在1.5Kbp以?xún)?nèi)。 2.病毒載體易突變和丟失，克隆過(guò)程中可能出現(xiàn)質(zhì)粒的包裝信號(hào)突變或大小不等的片段丟失，導(dǎo)致無(wú)法成功包裝出病毒。因此建議構(gòu)建好含有目的基因的克隆載體(尤其插入片段大于1.5Kbp)后首先進(jìn)行測(cè)序，以確保關(guān)鍵序列都正確無(wú)誤。 3.包裝細(xì)胞多選擇為293T或293FT。要求細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、狀態(tài)良好，避免過(guò)密生長(zhǎng)和體外傳代次數(shù)過(guò)多， 4.轉(zhuǎn)染時(shí)對(duì)質(zhì)粒純度要求較高，最好為去掉內(nèi)毒素的超螺旋質(zhì)粒，以提高轉(zhuǎn)染效率。多采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法，既節(jié)約成本又可獲得高的轉(zhuǎn)染效率(一般可達(dá)到80%~95%)。 5.無(wú)論是三質(zhì)�；蛩馁|(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染的各質(zhì) 粒之間的比例非常重要，直接影響出毒效率。不同公司提供的質(zhì)粒有所差別，因此無(wú)法一概而論，需要根據(jù)給出的比例進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。 6.轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞密度控制在50%~60%為佳。轉(zhuǎn)染前4~8h換液，轉(zhuǎn)染后不換液。轉(zhuǎn)染第2天添加丁酸鈉(TPA)可明顯提高出毒率，之后8h再換液。每次換液前應(yīng)將培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃℃，換液時(shí)動(dòng)作輕柔以防細(xì)胞漂起 7.一般情況下，轉(zhuǎn)染48h后收獲得到的病毒顆粒最多，但也與當(dāng)時(shí)細(xì)胞狀態(tài)、生長(zhǎng)速度和培養(yǎng)基pH值有關(guān)。收獲病毒時(shí)培養(yǎng)基應(yīng)呈紅色，若過(guò)酸呈現(xiàn)黃色則會(huì)降低病毒收獲率 8.不同廠(chǎng)家和批次的血清對(duì)病毒的產(chǎn)量影響很大需要篩選。 發(fā)自小木蟲(chóng)手機(jī)客戶(hù)端 |
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