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我太秀了銅蟲(chóng) (小有名氣)
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干貨丨GL261細(xì)胞培養(yǎng)與基因編輯技巧指南
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作為一種源自 C57BL/6 小鼠的經(jīng)典神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型，GL261細(xì)胞因其具有明確的免疫原性，且可在免疫系統(tǒng)完整的小鼠中順利建模，成為研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）免疫治療的重要利器。無(wú)論是在解析 PD-1/PD-L1 通路機(jī)制、評(píng)估 CAR-T 或 NK 細(xì)胞的治療潛力，還是在構(gòu)建 CRISPR/Cas9 功能篩選體系中，GL261細(xì)胞都表現(xiàn)出卓越的適用性，是開(kāi)展腦腫瘤免疫研究的理想模型。 本期內(nèi)容將帶你全面了解 GL261 的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，從細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵細(xì)節(jié)，到提升實(shí)驗(yàn)效率的實(shí)用策略，助你在神經(jīng)腫瘤研究中取得更加穩(wěn)健而高效的進(jìn)展！ 細(xì)胞信息 細(xì)胞名稱：GL261（小鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤） 生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng) 細(xì)胞形態(tài)：上皮樣，貼壁細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)條件：90%DMEM+10%FBS； 氣相：空氣，95%；CO2，5%； 溫度：37℃ 換液頻次：2-3天換液一次 傳代比例：1：2-1：3 細(xì)胞生長(zhǎng)正常圖片：細(xì)胞貼壁，輪廓清晰，細(xì)胞邊緣整齊。培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞間無(wú)大量碎片或者細(xì)胞分泌物。 細(xì)胞異常圖片：少量貼壁細(xì)胞，細(xì)胞輪廓不夠清晰。培養(yǎng)過(guò)程中有大量的細(xì)胞分泌物和細(xì)胞碎片。 細(xì)胞復(fù)蘇 1) 準(zhǔn)備工作：預(yù)熱水浴鍋至37℃，預(yù)熱完全培養(yǎng)基，準(zhǔn)備好細(xì)胞； 2) 在超凈臺(tái)內(nèi)吸取 7 mL 已預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基至 15 mL 離心管中； 3) 將細(xì)胞從干冰里取出，用鑷子夾住蓋子放入 37℃水浴中快速晃動(dòng)（注意：水不能沒(méi)過(guò)蓋子），使其在 1 分鐘左右完全融化； 4) 用單道移液器將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至步驟2）提前準(zhǔn)備好的15ml離心管中，蓋上蓋子，離心1100 rpm 室溫 4 分鐘； 5) 超凈臺(tái)內(nèi)棄上清，吸取 1 mL 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至裝有 4 mL 完全培養(yǎng)基的 T25 cm2培養(yǎng)瓶 (或者 6cm 的皿) 中，寫(xiě)上細(xì)胞名稱、復(fù)蘇日期、 代次，放置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 6) 第二天觀察細(xì)胞狀態(tài)。 細(xì)胞傳代 1) 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%匯合度即可傳代。在超凈臺(tái)內(nèi)把培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液倒至廢液缸，用1×PBS（T25 cm2培養(yǎng)瓶添加約2~3mL，T75 cm2培養(yǎng)瓶約4~5 mL）洗滌細(xì)胞1~2次，以去除殘余的培養(yǎng)液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）； 2) 加入相應(yīng)體積的胰酶溶液，輕輕晃動(dòng)瓶子并使胰酶完全浸過(guò)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱孵育1~2分鐘，待在顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞變圓不貼壁，輕輕晃動(dòng)和敲擊培養(yǎng)瓶?jī)蓚?cè)有大量細(xì)胞脫離時(shí)，立即終止消化； 表1 3) 加入2倍胰酶體積的完全培養(yǎng)液終止消化，并輕吹打細(xì)胞數(shù)次，使所有細(xì)胞徹底脫壁；注意：吹散細(xì)胞時(shí)注意要輕柔，盡量不產(chǎn)生氣泡或盡可能產(chǎn)生少量氣泡。 4) 用10 mL移液管轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到一支50 mL離心管中，同一批次的細(xì)胞可以合并收集在一起，視情況用適量 PBS將培養(yǎng)瓶里的殘余細(xì)胞洗下來(lái)，一起加到50mL離心管中。蓋上蓋子，做好標(biāo)記； 5) 1100 rpm室溫離心4分鐘，離心后，打開(kāi)蓋子棄上清，加2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞； 6) 細(xì)胞按照一定的接種比例傳代，首次按照1：2進(jìn)行傳代，若細(xì)胞在兩天內(nèi)長(zhǎng)滿可增加傳代比例。 細(xì)胞凍存 1）將培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)移至離心管中； 2）1100rpm離心4min，離心結(jié)束棄去上清，加入適量4℃預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞，然后吸取20μL細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞密度為5*10^6~1*10^7個(gè)細(xì)胞/mL； 3）按 1 mL/管分裝至凍存管中，將凍存管放置于凍存盒中然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱； 4）過(guò)夜后，將凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮罐內(nèi)保存。 培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞碎片、細(xì)胞分泌物過(guò)多或者藥篩后死細(xì)胞過(guò)多 1) 若培養(yǎng)過(guò)程中死細(xì)胞過(guò)多，可以通過(guò)勤換液（隔天或者每天換液），且用優(yōu)質(zhì)的澳胎血清。 2) 若培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞分泌物、細(xì)胞碎片過(guò)多；可以將細(xì)胞消化下來(lái)，終止消化后用PBS洗滌細(xì)胞團(tuán)，重懸后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中離心（1100rpm離心4min），離心結(jié)束盡可能的吸干凈PBS，可重復(fù)此步驟兩次，根據(jù)離心下來(lái)的細(xì)胞量接種至合適的培養(yǎng)容器中。 凍存復(fù)蘇活率低（存活率低） GL261細(xì)胞容易受到凍存的影響，為了提高復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞存活率需要在凍存時(shí)加大凍存密度，一般建議凍存時(shí)細(xì)胞密度為1*10^6-2*10^6。在復(fù)蘇時(shí)可先把細(xì)胞復(fù)蘇至1-2個(gè)6孔，待細(xì)胞恢復(fù)狀態(tài)后再轉(zhuǎn)移至更大表面積的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 如何提高單克隆形成率 1. 鋪克隆時(shí)細(xì)胞活率需要＞90% 2. 稀釋細(xì)胞計(jì)數(shù)后結(jié)果最好落在1*10^6-2*10^6之間 3. 鋪克隆時(shí)建議使用優(yōu)質(zhì)澳洲胎牛血清 4. 鋪克隆時(shí)建議用PBS清洗細(xì)胞團(tuán)兩次 5. 可先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)找到合適的鋪克隆梯度，避免單克隆占比太低 6. 細(xì)胞接種96孔板時(shí)需確保細(xì)胞分布均勻 細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)注意事項(xiàng) 1. 細(xì)胞活率＞90%，細(xì)胞狀態(tài)正常，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞邊緣整齊。 2. 轉(zhuǎn)染過(guò)程中操作需輕柔 3. 選擇電穿孔法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)需選擇合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)，避免參數(shù)不合適導(dǎo)致轉(zhuǎn)染后大量細(xì)胞死亡 4. 病毒感染法進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)找到最適MOI及最佳藥篩濃度；確保感染的病毒滴度達(dá)標(biāo)；感染前添加助染劑Polybrene；感染時(shí)建議12孔板內(nèi)進(jìn)行。 注意事項(xiàng) 1. GL261細(xì)胞在凍存時(shí)細(xì)胞活率建議大于90%，每管凍存細(xì)胞量控制在5*10^6-1*10^7/ml 2. GL261細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)有細(xì)胞分泌物和細(xì)胞碎片產(chǎn)生，建議每隔一代傳代的時(shí)候，用PBS洗滌細(xì)胞團(tuán)，以減少細(xì)胞分泌物和細(xì)胞碎片對(duì)細(xì)胞增值、細(xì)胞狀態(tài)的影響。 3. GL261細(xì)胞有密度依賴，傳代比例不宜過(guò)大，建議是1：2-1：3。 4. GL261細(xì)胞對(duì)機(jī)械力較敏感。正常培養(yǎng)時(shí)，可輕柔吹打細(xì)胞，盡量避免吹打力度過(guò)大而導(dǎo)致細(xì)胞分化和造成細(xì)胞死亡 5. 培養(yǎng)時(shí)控制好細(xì)胞密度，培養(yǎng)、傳代時(shí)讓細(xì)胞處于一個(gè)合適的密度范圍 6. GL261細(xì)胞對(duì)胎牛血清質(zhì)量比較敏感，建議使用優(yōu)質(zhì)澳洲胎牛血清 |
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