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津渡津渡的生科捐助貴賓 (初入文壇)
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簡(jiǎn)易版 | 核酸分離與純化、沉淀與濃縮？（附：避免踩雷的黃金步驟）
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核酸提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，其質(zhì)量直接影響后續(xù)PCR、測(cè)序等結(jié)果的可靠性。 1. 核酸分離與純化 - 去蛋白技術(shù)： - 酚/氯仿抽提：交替使用飽和酚和氯仿（比例1:1），氯仿去除色素和蔗糖，異戊醇減少氣泡； - 硅膠柱/磁珠法：商用試劑盒首選（如Qiagen、天隆科技），磁珠結(jié)合核酸后磁性分離，適合自動(dòng)化操作。 - 雜質(zhì)清除： 有機(jī)相抽提后，氯仿二次處理去除殘留酚，乙醚抽提去除痕量氯仿。 2. 核酸沉淀與濃縮 - 乙醇沉淀法： - 加入2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇 + 0.1倍體積3M醋酸鈉（Na⁺中和電荷促進(jìn)聚合）； - 低溫離心（4℃，12,000g × 15min），75%乙醇洗滌鹽分。 - 干燥溶解： 沉淀室溫干燥5min（避免過(guò)度干燥），用TE緩沖液或RNase-free水溶解。 3. 避免踩雷的黃金步驟 1. 樣本前處理： - 組織塊≤25mg，血液≤200μl，過(guò)量降低裂解效率。 2. 裂解充分性： - 裂解液體積＞樣本體積3倍，55℃孵育≥30min（組織需延長(zhǎng)）。 3. 抽提技巧： - 吸取上清時(shí)留1mm液層，避免吸入蛋白層。 4. 沉淀優(yōu)化： -20℃沉淀過(guò)夜提升小片段回收率。 5. 污染應(yīng)急： - 若假陽(yáng)性頻發(fā)：更換引物、使用核酸清除劑（如諾沃賽德，無(wú)腐蝕性）。 |
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