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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » 如何精準定量核酸濃度
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Longlight鐵蟲 (初入文壇)
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如何精準定量核酸濃度
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一、紫外分光光度法（Nanodrop） 原理：核酸的堿基（嘌呤、嘧啶）在260 nm波長處有最大紫外吸收峰，通過吸光值（A260）結合摩爾吸光系數計算濃度。DNA的換算系數為50 μg/mL，RNA為40 μg/mL。 特點： • 操作簡便，1分鐘內完成檢測。 • 無法區(qū)分DNA/RNA、降解核酸及雜質，需結合A260/A280（>1.8為DNA純品，>2.0為RNA純品）評估純度。 • 靈敏度較低（≥2 ng/μL），易受游離核苷酸干擾。 二、熒光染料法（如達遠辰光熒光計） 原理：特異性熒光染料（與目標核酸結合后發(fā)出熒光，通過熒光強度定量。例如，達遠辰光熒光計搭配賽默飛Qubit dsDNA HS染料檢測范圍為0.2–100 ng/μL。 特點： • 靈敏度高（pg級），特異性強，可區(qū)分DNA/RNA。 • 耗材成本相較于紫外分光法較高。 • 適用于低濃度/珍貴樣本（如NGS文庫）。 三、實時熒光定量PCR（qPCR） 原理：通過熒光染料或探針實時監(jiān)測PCR擴增過程，Ct值與起始模板濃度呈線性關系，結合標準曲線定量。 特點： • 特異性高，依賴引物/探針設計，可檢測拷貝數。 • 操作復雜，耗時較長，需標準品確保擴增效率一致。 • 適用于基因表達分析、病原體檢測等。 四、傳統(tǒng)化學法 1. 定磷法 • 原理：核酸中的磷在酸性條件下與鉬酸銨反應生成鉬藍，在650 nm處測吸光值，換算濃度。DNA/RNA含磷量分別為9.2%和9.5%。 • 特點：靈敏度較高（1–10 μg），但易受蛋白質干擾。 2. 定糖法 • 原理：核酸戊糖經酸解生成醛類，與成色劑（如苔黑酚）反應顯色，670 nm或595 nm測吸光值。 • 特點：操作簡單，但特異性差，僅適用于粗略估算。 五、其他方法 1. 毛細管電泳法 • 原理：基于熒光染料結合核酸，通過遷移時間和峰面積定量，可評估核酸完整性（如RNA降解程度）。 • 特點：靈敏度高（25 ng/μL），但單樣成本較高。 2. 數字PCR（dPCR） • 原理：將樣本分割成微滴獨立擴增，統(tǒng)計陽性微滴數實現絕對定量，不受擴增效率影響。 • 特點：適用于稀有突變檢測、病毒載量測定等。 選型建議 • 常規(guī)檢測：優(yōu)先選擇紫外分光光度法（快速便捷）或Qubit熒光法（高靈敏度）。 • 復雜樣本：如NGS文庫，推薦毛細管電泳或數字PCR。 • 絕對定量需求：使用qPCR或數字PCR |
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