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zhiqiang2013新蟲 (初入文壇)
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ELISA試驗(yàn)中不容忽視的細(xì)節(jié)盤點(diǎn)
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ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。測(cè)定中影響因素較多，操作中有一定的技術(shù)要求，檢測(cè)過程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：①標(biāo)本因素；②試劑因素；③操作因素。下面上海酶聯(lián)生物就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。 樣品稀釋 酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性。因此，國外檢測(cè)血清抗體的試劑盒，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗(yàn)確定，以保證試驗(yàn)靈敏度和特異性。但是，有些用戶未能嚴(yán)格按說明書操作，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋，個(gè)別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠，因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)問題。 試劑盒平衡 試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫(約25℃)，一般需在室溫放置20～30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。 樣品和試劑的混勻 稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均一性。 加樣 在ELISA商品試劑盒中，有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。 溫育 溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。擅自改變說明書操作，使用自己喜歡的溫育時(shí)間和溫育溫度，造成一些不必要的麻煩。因?yàn)�，不同試劑盒有不同的溫育時(shí)間和溫育溫度的選擇，隨意更改溫育時(shí)間或者溫育溫度將導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。 |
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