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我太秀了銅蟲 (小有名氣)
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CRISPR文庫(kù)與腫瘤免疫共培養(yǎng)：精準(zhǔn)破解免疫治療新靶點(diǎn)
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近年來(lái)，CRISPR基因編輯技術(shù)結(jié)合腫瘤-免疫細(xì)胞共培養(yǎng)模型，為癌癥免疫治療的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)提供了全新視角。通過模擬腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞互作，科學(xué)家們能夠系統(tǒng)性解析免疫逃逸機(jī)制，并篩選出關(guān)鍵調(diào)控基因。小源帶你了解最新研究進(jìn)展： 1.腫瘤-免疫共培養(yǎng)模型 在CRISPR篩選中，共培養(yǎng)系統(tǒng)通常包含以下要素：細(xì)胞類型選擇，腫瘤細(xì)胞（如肺癌、黑色素瘤細(xì)胞系）與免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞、NK細(xì)胞）共培養(yǎng)，模擬體內(nèi)免疫攻擊場(chǎng)景[1]�；蚓庉嫴呗�，通過CRISPR敲除腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞中的候選基因庫(kù)，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)篩選影響免疫殺傷的關(guān)鍵基因。功能評(píng)估指標(biāo)，包括T細(xì)胞活化標(biāo)志物（如CD69、IFN-γ分泌）、腫瘤細(xì)胞殺傷效率及免疫檢查點(diǎn)分子（如PD-L1、MHC-I）的動(dòng)態(tài)變化。 2. 免疫逃逸文庫(kù)篩選案例全析 在腫瘤細(xì)胞系中應(yīng)用CRISPR篩選技術(shù)，為全面且高效地研究大量基因提供了有力手段，進(jìn)而得以在深入探究的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中精準(zhǔn)識(shí)別關(guān)鍵調(diào)控因子。這些信號(hào)網(wǎng)絡(luò)涉及一系列至關(guān)重要的生物學(xué)過程，如抗原呈遞、干擾素-γ（IFN-γ）信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）信號(hào)傳導(dǎo)、自然殺傷（NK）細(xì)胞毒性敏感性以及巨噬細(xì)胞募集等。通過以下案例進(jìn)行深度剖析： 案例1 靶細(xì)胞：小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（MC38） 效應(yīng)細(xì)胞：PmelT細(xì)胞 文庫(kù)名稱：小鼠全基因組敲除文庫(kù) 壓力篩選條件：對(duì)于T細(xì)胞處理組，以效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞（E:T）比例為0.3:1和1:1加入培養(yǎng)的PmelT細(xì)胞處理16小時(shí)。對(duì)于非T細(xì)胞處理組，加入等量的T細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，檢測(cè)對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的體外敏感性或抗性。 結(jié)果：研究揭示了兩種不同的免疫抵抗調(diào)節(jié)器，并展示了它們作為治療靶點(diǎn)提高免疫療法療效的潛力。在這些調(diào)節(jié)器中，PRMT1和RIPK1分別被確定為一種雙重免疫抵抗調(diào)節(jié)器和一種細(xì)胞毒性抵抗調(diào)節(jié)器。盡管不同類型的免疫療法之間的影響程度有所不同，但基因靶向PRMT1和RIPK1能使腫瘤對(duì)T細(xì)胞殺傷和抗PD-1/OX40治療更為敏感[2]。 案例2 靶細(xì)胞：人黑色素瘤細(xì)胞（Mel624） 效應(yīng)細(xì)胞：病人的NY-ESO-1細(xì)胞 文庫(kù)名稱：人全基因組敲除文庫(kù) 壓力篩選條件：NY-ESO-1T細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞[E:T]比例為1:3），對(duì)照組在相同的密度和條件下培養(yǎng)，但沒有T細(xì)胞。共培養(yǎng)階段維持了12小時(shí)之后移除T細(xì)胞，恢復(fù)48小時(shí)，NY-ESO-1T細(xì)胞裂解了約76%的腫瘤細(xì)胞，存活的細(xì)胞進(jìn)行sgRNA的富集分析。第二次篩選，將E:T比例提高到1:2，T細(xì)胞殺死了約90%的庫(kù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Mel624細(xì)胞。 結(jié)果：研究者通過腫瘤細(xì)胞對(duì)NY-ESO-1+CD8+T細(xì)胞的體外敏感性進(jìn)行CRISPR篩選來(lái)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)EFT的成熟基因和新基因。發(fā)現(xiàn)APLNR通過調(diào)節(jié)靶細(xì)胞中的JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)的新作用，APLNR的缺失抑制JAK-STAT通路，從而削弱IFN-γ應(yīng)答和對(duì)基于T細(xì)胞的免疫療法的敏感性；APLNR與JAK1相互作用增強(qiáng)IFNy應(yīng)答，APLNR可以進(jìn)一步提高腫瘤血管對(duì)IFNy的敏感性，從而提高T細(xì)胞的抗腫瘤功效[3]。 案例3 靶細(xì)胞：胰腺細(xì)胞系HupT3和KP4_MSLN 效應(yīng)細(xì)胞：MSLNCAR-T細(xì)胞 文庫(kù)名稱：人全基因組敲除文庫(kù) 壓力篩選條件：共培養(yǎng)條件取決于t細(xì)胞供體、腫瘤細(xì)胞類型和平板格式，T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的E:T比分別為4,2,1，使用等量的T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，共培養(yǎng)允許進(jìn)行24-72小時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)或熒光素酶法對(duì)存活的靶細(xì)胞進(jìn)行定量。 結(jié)果：為探究腫瘤內(nèi)在耐藥模式，研究者使用表達(dá)間皮素（MSLN）的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行CRISPR篩選，然后與靶向MSLN的CART細(xì)胞共培養(yǎng)，研究MSLN-CAR-T細(xì)胞的體外敏感性，發(fā)現(xiàn)抗原依賴性和抗原非依賴性的耐藥模式。抑制參與GPI錨生物合成途徑的基因增加胰腺腫瘤細(xì)胞對(duì)MSLNCAR-T細(xì)胞療法的抗性。參與死亡受體途徑的基因使胰腺導(dǎo)管腺癌對(duì)CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感。TFAP4缺失促進(jìn)p65（NF-kB轉(zhuǎn)錄因子）活性[4]。 案例4 靶細(xì)胞：人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562 效應(yīng)細(xì)胞：健康人外周血提取的NK細(xì)胞 文庫(kù)名稱：人全基因組敲除文庫(kù) 壓力篩選條件：將K562文庫(kù)細(xì)胞與IL-2激活的NK細(xì)胞以E/T比例0.3:1共培養(yǎng)并監(jiān)測(cè)K562細(xì)胞的存活率，過程中可添加NK細(xì)胞，直至K562細(xì)胞的存活率僅為10%，去除死細(xì)胞和NK細(xì)胞，回收存活的K562細(xì)胞。在篩選壓力較低的實(shí)驗(yàn)組中，回收的K562細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后再提取基因組DNA。在篩選壓力較高的實(shí)驗(yàn)組中，再次通過兩輪與NK細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行篩選。對(duì)照K562細(xì)胞在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，不接觸NK細(xì)胞。其中實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行了兩次技術(shù)重復(fù)。 結(jié)果：研究者使用K562細(xì)胞進(jìn)行CRISPR篩選NK細(xì)胞殺傷作用敏感性的基因，在與NK細(xì)胞共孵育后存活下來(lái)的K562細(xì)胞中，編碼天然細(xì)胞毒性受體NKp30配體的NCR3LG1的缺失保護(hù)K562細(xì)胞免受NK細(xì)胞的殺傷。相比之下，調(diào)節(jié)抗原呈遞和干擾素-γ信號(hào)通路的基因的缺失增加了K562細(xì)胞的易感性，加入IFN-γ中和抗體增加了K562細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用的敏感性[5]。 3. 展望 CRISPR 篩選技術(shù)借助 CRISPR - Cas9 系統(tǒng)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行編輯，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因功能的系統(tǒng)性和可擴(kuò)展性的探究。在癌癥免疫治療領(lǐng)域，該技術(shù)已助力 發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫反應(yīng)性以及免疫干預(yù)有效性的基因、生物標(biāo)志物和信號(hào)通路。未來(lái)，針對(duì)CRISPR編輯的CAR-T細(xì)胞聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑這些聯(lián)合療法有望突破現(xiàn)有治療瓶頸！ 源井提供CRISPR文庫(kù)一站式定制服務(wù)，還有其他相關(guān)細(xì)胞的基因編輯（KO/KI/PM）以及穩(wěn)轉(zhuǎn)定制服務(wù)，歡迎咨詢！ |
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