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EPRUIbiotech新蟲 (初入文壇)
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[交流]
鏈霉親和素磁珠在使用過程中的問題及對應(yīng)方法整理 已有2人參與
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1.鏈霉親和素磁珠在使用磁力架時無法沉淀，如何解決？ 可能樣品溶液粘度過高或者由于蛋白-蛋白相互作用，磁珠形成了聚集體。解決辦法：1.延長分離時間（將管子放在磁力架上2-5分鐘）。2.裂解物加入DNase酶（0.01mg/ml）。3.將Tween 20濃度提高至結(jié)合和/或者0.05%洗滌緩沖液。4.向結(jié)合緩沖液和或洗滌緩沖液加入20mMβ-巰基乙醇。 2.鏈酶親和素是否會從鏈酶親和素磁珠中脫落？ 鏈霉親和素分子與磁珠表面共價結(jié)合；在正常的推薦條件下，脫落可忽略不計 (37℃下，鏈霉親和素分子總量不到0.2%)。然而，應(yīng)該注意的是，并非所有的四個鏈霉親和素亞單元都與磁珠是共價偶聯(lián)的。通常，一個或兩個亞單元共價偶聯(lián)。鏈霉親和素與其它蛋白類似，如果加熱會變性并解聚為亞基。如果鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠被煮過，一些鏈霉親和素亞基可能會從磁珠上釋放出來（以單體或者聚合物形式）。共價偶聯(lián)的鏈霉親和素亞基不受這種處理的影響。當(dāng)鏈霉親和素與生物素偶聯(lián)時，鏈霉親和素—生物素復(fù)合物比單獨的鏈霉親和素更加穩(wěn)定。 3.如果鏈酶親和素磁珠被意外冷凍了是否還能使用？ 仍然可以使用，為了在實驗室內(nèi)測試低溫下的穩(wěn)定性，將鏈霉親和素磁珠在 -20 ℃下放置 24 小時，然后將其轉(zhuǎn)移到室溫 (15-25℃) 下72 小時。 此凍融循環(huán)重復(fù) 4 次，并將磁珠在 2-8℃條件下儲存 60 個月。然后檢測了生物素結(jié)合能力，并發(fā)現(xiàn)其符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。 4.如何優(yōu)化鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)的磁珠結(jié)合能力？ 鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠的結(jié)合能力具有片段長度依賴性。對大分子DNA 或 RNA 片段結(jié)合能力的下降可能是由于空間位阻所致。以下是一些優(yōu)化結(jié)合能力的建議。 鹽濃度會影響生物素化核酸與鏈霉親和素磁珠的結(jié)合效率。生物素化DNA片段 (長達 1 kb) 的較優(yōu)結(jié)合條件是在1 M NaCl (最終濃度) ，5°C和孵育15分鐘下實現(xiàn)的。更長的DNA片段應(yīng)固定過夜。生物素化抗體應(yīng)在 pH 7.4 的PBS 緩沖液中固定，并添加 0.1% 的 BSA。 請確保樣品中沒有過量的游離生物素，因為游離生物素會比較大的生物素化分子更快地結(jié)合鏈霉親和素磁珠。生物素化寡核苷酸應(yīng)通過反相 HPLC 或 FPLC 進行回收，以去除樣品中的游離生物素。 我們還建議根據(jù)每個特定應(yīng)用的需要進行滴定實驗，以優(yōu)化使用的磁珠數(shù)量，因為特定分子的大小和生物素化過程都會影響磁珠的結(jié)合能力。 5.使用的鏈霉親和素磁珠出現(xiàn)了核酸的非特異性結(jié)合問題。我能做些什么來減少此種情況？ 保持高 pH 值和低鹽濃度，這將有助于保持核酸和磁珠上的負(fù)電荷。 6.使用鏈酶親和素磁珠得到了高背景，如何防止這種情況發(fā)生？ 背景可能是由于磁珠表面與 BSA 的非特異性結(jié)合所致，或者高背景可能是由于與鏈霉親和素的非特異性結(jié)合引起的。增加 pH 值或鹽濃度可能有助于減少結(jié)合。 7.如果鏈酶親和素磁珠聚集，應(yīng)該怎么辦？ 鏈霉親和素磁珠具有帶負(fù)電荷的表面，磁珠的表面電荷可能會導(dǎo)致一些樣品中的磁珠浮在液面上，或變得粘稠或聚集。粘性可能是由于磁珠之間或磁珠與管壁之間的靜電相互作用造成的。通常，我們建議在進行實驗之前，用諸如 Tween 20 去污劑的非離子去污劑洗滌磁珠。通常只需將 Tween 20 去污劑加入到磁珠中，最終濃度可達到0.1%，然后在不含去污劑的緩沖液中重懸并洗滌磁珠，就可以減少或消除這個問題�？赡苄枰� Tween 20 溶液中孵育，例如在室溫下滾動孵育 5-10 分鐘。此外，我們建議使用硅化管。這種處理很可能降低磁珠的靜電電勢。 8.在使用鏈霉親和磁珠進行mRNA分離后出現(xiàn)DNA污染的情況，為什么會這樣？ 有以下幾種原有：1.DNA 剪切不完整。 2.雜交步驟后未完全去除樣品裂解物。 3.洗滌不充分和/或未完全去除洗滌緩沖液。 4.樣品與磁珠的比率過高。 |
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