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Abbkine亞科因新蟲 (初入文壇)
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乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量檢測試劑盒實驗解決方案
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原理 乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶A匯聚成一條共同的代謝通路--三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于ATP合成。此外，乙酰輔酶A是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。CheKine™ 乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量檢測試劑盒（微量法）提供了一種簡單、靈敏、快速的乙酰輔酶A檢測方法，適合多種類型的樣本，如動/植物組織、細(xì)胞等樣本。其檢測原理是蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng)，乙酰輔酶A含量和NADH的生成速率成正比，NADH在340 nm處有特征吸收峰，通過檢測340 nm吸光值的計算既可得到乙酰輔酶A含量。 自備耗材 ·酶標(biāo)儀或紫外分光光度計（能測340 nm處的吸光度） ·制冰機，低溫離心機 ·水浴鍋 ·96孔UV板或微量石英比色皿 ·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭 ·去離子水 ·勻漿器（如果是組織樣本） 試劑準(zhǔn)備 Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。 注意：Extraction Buffer有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實驗。 Working ReagentⅠ：臨用前配制，對于48 T，加入175 μL ReagentⅣ充分溶解備用；對于96 T，加入350 μL ReagentⅣ充分溶解備用，未用完的試劑-20℃避光分裝保存2周。 Working ReagentⅡ：臨用前配制，對于48 T，加入175 μL ReagentⅣ充分混勻備用；對于96 T，加入350 μL ReagentⅣ充分溶解備用，未用完的試劑4℃避光分裝保存2周。 Working ReagentⅢ：臨用前配制，對于48 T，加入15.75 mL ReagentⅣ充分溶解備用；對于96 T，加入31.5 mL ReagentⅣ充分溶解備用，未用完的試劑-20℃避光分裝保存2周。 工作液：臨用前配制，將Working ReagentI、Working ReagentⅡ和Working ReagentⅢ按照1:1:90的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。 Standard (NADH)：臨用前配制，對于48 T，加入0.5 mL去離子水充分溶解備用；對于96 T，加入1 mL去離子水充分溶解備用，得8,000 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，未用完的試劑-20℃避光分裝保存2周。 標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：按照如下表格，用去離子水將8,000 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為3,200、1,600、800、400、200、100、50、0 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 序號 標(biāo)準(zhǔn)液體積 去離子水體積（µL） 濃度（nmol/mL） Std.1 100 µL 8,000 nmol/mL 150 3,200 Std.2 100 µL of Std.1 (3,200 nmol/mL) 100 1,600 Std.3 100 µL of Std.2 (1,600 nmol/mL) 100 800 Std.4 100 µL of Std.3 (800 nmol/mL) 100 400 Std.5 100 µL of Std.4 (400 nmol/mL) 100 200 Std.6 100 µL of Std.5 (200 nmol/mL) 100 100 Std.7 100 µL of Std.6 (100 nmol/mL) 100 50 Std.8 0 200 0 注意：每次實驗都要做一次標(biāo)準(zhǔn)品檢測，制作標(biāo)曲；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時內(nèi)使用。Std.8即空白孔。 樣本制備 注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。 1.細(xì)胞樣本：收集細(xì)胞樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬細(xì)胞加入1 mL Extraction Buffer，超聲破碎細(xì)胞（功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次），13,000 g，4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。 2.組織樣本：稱取0.1 g組織，加入1 mL Extraction Buffer，進(jìn)行冰浴勻漿，13,000 g，4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。 注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3002的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。 實驗步驟 1.酶標(biāo)儀或紫外分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到340 nm，紫外分光光度計用去離子水調(diào)零。 2.工作液于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育10 min。 3.操作表：在96孔UV板或微量石英比色皿中，按照下表進(jìn)行實驗 試劑 測定孔（μL） 標(biāo)準(zhǔn)孔（μL） 樣本 25 0 不同濃度的Std. 0 25 工作液 230 230 4.混勻，測定孔立即讀取340 nm處20秒的吸光值A(chǔ)1和1分20秒時的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA測定=A2-A1，標(biāo)準(zhǔn)孔讀取340 nm處1分20秒時的吸光值A(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。 注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果吸光度大于1.5，可以減少樣本量，如果吸光度太低，可以減少Extraction Buffer體積。 結(jié)果計算 注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎剑ㄍ茖?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。 以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為x軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為y軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程，將ΔA測定帶入方程，得到y(tǒng)值。 1. 按樣本蛋白濃度計算： 乙酰輔酶A含量(nmol/mg prot)=(y×V樣)÷(V樣×Cpr)=y÷Cpr 2. 按樣本鮮重計算： 乙酰輔酶A含量(nmol/g 鮮重)=(y×V樣)÷(W×V樣÷V提取)=y÷W 3. 按細(xì)胞密度計算： 乙酰輔酶A含量(nmol/104 cells)=(y×V樣)÷(500×V樣÷V提取)=y÷500 V樣：加入樣本體積，0.025 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；V提�。杭尤胩崛∫后w積，1 mL；500：細(xì)胞總數(shù)，500萬。 結(jié)果展示 參考標(biāo)曲如下： Figure 1. NADH的標(biāo)準(zhǔn)曲線 |
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