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Abbkine亞科因新蟲(chóng) (初入文壇)
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線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟
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原理 線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP），又稱(chēng)線(xiàn)粒體巨型通道（magachannel），是存在于線(xiàn)粒體內(nèi)外膜之間的非選擇性高導(dǎo)電性通道，由多種蛋白質(zhì)復(fù)合組成。線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）可能參與了細(xì)胞死亡過(guò)程中線(xiàn)粒體成分的釋放。正常的細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)膜可維持正常的線(xiàn)粒體電位梯度以保證細(xì)胞呼吸作用及能量供應(yīng)，隨著Ca2+的攝入和釋放，一種低電導(dǎo)滲透性轉(zhuǎn)換孔在張開(kāi)和閉合中來(lái)回切換。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)和病理性死亡時(shí)，線(xiàn)粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔滲透性發(fā)生改變，Ca2+的過(guò)載，線(xiàn)粒體谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼細(xì)胞色素C的釋放，線(xiàn)粒體膜電位下降等都會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的激活。線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測(cè)試劑盒是一種相對(duì)于僅基于線(xiàn)粒體膜電位分析更直接的檢測(cè)線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放的檢測(cè)方法。其原理是：首先通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸加載Calcein AM，后者是一種對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，能夠輕易穿透活細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，使胞質(zhì)包括線(xiàn)粒體發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。加入CoCl2后，來(lái)自胞漿的熒光被CoCl2淬滅，僅留下線(xiàn)粒體內(nèi)的熒光。作為對(duì)照，可將細(xì)胞加載Calcein AM和CoCl2 的同時(shí)，對(duì)其用Ionomycin處理，從而使細(xì)胞加載更多的Ca2+，引起線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的激活從而使線(xiàn)粒體熒光淬滅。 自備耗材 ·細(xì)胞培養(yǎng)板、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭 ·離心機(jī) ·熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀 ·PBS 試劑準(zhǔn)備 Calcein AM staining solution：每1 mL Assay buffer加入1 μL的Calcein AM (1000X)，混勻。 注意：Calcein AM的最終濃度需根據(jù)不同細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)體系通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。Calcein AM的推薦工作濃度為1×，可以在0.5×-5×之間進(jìn)行調(diào)整。 Fluorescence quenching solution：每1 mL Calcein AM staining solution中加入10 μL的CoCl2 (100×)，混勻。 注意：CoCl2的終濃度推薦為1×，通常此時(shí)的淬滅效果比較好。CoCl2的終濃度也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)中所使用細(xì)胞的種類(lèi)進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，以摸索出最佳的淬滅效果，可在0.1×-1×之間進(jìn)行調(diào)整。 Ionomycin control：每1 mL Fluorescence quenching solution中加入5 μL的Ionomycin (200×)，混勻。 注意：Ionomycin的終濃度建議為1×，也可以在0.5×-5×之間進(jìn)行調(diào)整。 實(shí)驗(yàn)步驟 注意：本試劑盒（100 T）96孔板每孔檢測(cè)體系100 μL時(shí)可以檢測(cè)1,000 T。 A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 1.用預(yù)期的方法處理細(xì)胞； 2.對(duì)于非貼壁細(xì)胞，300 g離心5 min收集細(xì)胞，用PBS清洗2次，棄去PBS。對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰蛋白酶（不含 EDTA）消化細(xì)胞，然后300 g離心5 min離心收集細(xì)胞，用PBS清洗2次，棄去PBS。 注意：需準(zhǔn)備懸浮在Assay Buffer的細(xì)胞樣本，用于流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)的陰性對(duì)照。 3.分別加入適當(dāng)體積的Calcein AM staining solution、Fluorescence quenching solution、Ionomycin control重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度約為1×106/mL，37℃避光孵育30-45 min，不同的細(xì)胞最佳孵育時(shí)間有所不同。 4.孵育完成后，300g離心5 min收集細(xì)胞。每個(gè)樣品加入1mL Assay Buffer，輕輕重懸，300g離心5 min收集細(xì)胞。 5.用400 μL Assay Buffer重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀分析。 B.熒光顯微鏡檢測(cè) 1.對(duì)于貼壁細(xì)胞： (1)在合適的孔板上培養(yǎng)細(xì)胞，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至少24 h，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 (2)用預(yù)期的方法處理細(xì)胞，在不含誘導(dǎo)劑條件下孵育細(xì)胞建立陰性對(duì)照組。 (3)用 PBS 清洗細(xì)胞2次。 (4)分別加入適當(dāng)體積Calcein AM staining solution、Fluorescence quenching solution、Ionomycin control到細(xì)胞中，通常96孔板每孔加入100μL，24孔板每孔加入250 μL，12孔板每孔加入500 μL，6孔板每孔加入1 mL，37℃避光孵育30-45 min，不同的細(xì)胞最佳孵育時(shí)間有所不同。 (5)孵育結(jié)束后，更換成新鮮的37℃預(yù)熱的培養(yǎng)液，37℃再避光孵育30min，以保證細(xì)胞內(nèi)酯酶充分水解Calcein AM以生成有綠色熒光的Calcein。 (6)用PBS清洗2-3次，然后加入Assay Buffer即可在熒光顯微鏡下觀察（Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm）。 2.對(duì)于懸浮細(xì)胞： (1)用預(yù)期的方法處理細(xì)胞，計(jì)數(shù)。 (2)取適當(dāng)細(xì)胞300 g離心5 min，棄上清，用PBS清洗細(xì)胞2次，棄去PBS。 (3)分別加入適當(dāng)體積的Calcein AM staining solution、Fluorescence quenching solution、Ionomycin control重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度約為1×106/mL，37℃避光孵育30-45 min，不同的細(xì)胞最佳孵育時(shí)間有所不同。 (4)300g離心5 min，吸除上清液，緩慢加入1 mL 37℃預(yù)熱的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，37℃再避光孵育30min，以保證細(xì)胞內(nèi)酯酶充分水解Calcein AM以生成有綠色熒光的Calcein。 (5)300g離心5 min，吸除大部分培養(yǎng)液，將細(xì)胞重懸后涂片，在熒光顯微鏡下觀察。 |
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