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Abbkine亞科因新蟲(chóng) (初入文壇)
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羥基抗氧化能力（HORAC）檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案
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原理 羥基抗氧化能力（Hydroxyl Radical Absorbance Capacity, HORAC）是一種檢測(cè)各種樣品中生物分子抗氧化能力的方法，可反映抗氧化劑轉(zhuǎn)移羥自由基的能力。CheKine™ 羥基抗氧化能力（HORAC）檢測(cè)試劑盒（熒光法）可檢測(cè)動(dòng)物或植物組織、細(xì)胞或細(xì)菌、血清（漿）等樣本，其原理是以熒光素鈉為熒光探針，芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，根據(jù)羥自由基破壞熒光探針，使熒光強(qiáng)度產(chǎn)生變化，熒光強(qiáng)度的變化大小反映自由基破壞的程度。在抗氧化劑存在時(shí)，它可以抑制由自由基引起的熒光變化。抑制程度反映了它對(duì)自由基的抗氧化能力。 自備耗材 ·熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm） ·全黑96孔板、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭 ·低溫離心機(jī)、恒溫箱、制冰機(jī) ·去離子水、PBS (pH 7.4)、丙酮 ·勻漿器（如果是組織樣本） 試劑準(zhǔn)備 1×Assay Buffer：使用前，Assay Buffer (2×)用去離子水稀釋成1×Assay Buffer，充分溶解待用。4℃保存。 1×ReagentⅠ：使用前，ReagentⅠ(100×)用1×Assay Buffer稀釋成1×ReagentⅠ，充分溶解待用。用不完的ReagentⅠ(100×)在-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。不要儲(chǔ)存稀釋的1×ReagentⅠ溶液。 1×ReagentⅡ：使用前，ReagentⅡ(32×)用去離子水稀釋成1×ReagentⅡ，充分溶解待用。4℃避光保存。 注意：ReagentⅡ有一定的刺激性，建議在使用過(guò)程中做好個(gè)人防護(hù)。 ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室溫。用不完的試劑在-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。 Trolox Standard (5 mM)：使用前，用1×Assay Buffer稀釋成0.1 mM濃度，充分溶解待用。用不完的Trolox Standard（5 mM）-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。 Standard設(shè)置：按下表所示，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 序號(hào) 0.1 mM標(biāo)準(zhǔn)品體積（µL） 1×Assay Buffer體積（µL） 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（µM） Std.1 80 120 40 Std.2 40 160 20 Std.3 20 180 10 Std.4 10 190 5 Std.5 5 195 2.5 Std.6 2.5 197.5 1.25 Std.7 0 200 0 注意：每次實(shí)驗(yàn)都要做一次標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，制作標(biāo)曲；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時(shí)內(nèi)使用。 樣本制備 注意：樣本以新鮮為宜，若不能立刻檢測(cè)，應(yīng)儲(chǔ)存在-80℃保存1個(gè)月。 1. 動(dòng)物組織：稱取0.1 g樣本，加入1 mL冷的1×Assay Buffer，冰浴勻漿，10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。 2. 植物組織：稱取0.1 g樣本，加入1 mL冷的1×Assay Buffer搗碎，冰浴超聲波破碎5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復(fù)30次），10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。 3. 細(xì)胞或細(xì)菌：收集500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入1 mL冷的1×Assay Buffer，冰浴超聲波破碎5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復(fù)30次），10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。 4. 血漿或血清：用1×Assay Buffer稀釋10倍或更多進(jìn)行檢測(cè)。 5. 液體樣本：10,000 g，4℃離心10 min，去除微粒，取上清液，置冰上待測(cè)。在進(jìn)行測(cè)定之前，根據(jù)需要稀釋上清液。 6. 親脂性樣本：親脂性樣本溶于100%丙酮中，用50%丙酮稀釋，在室溫下孵育1 h，10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。在進(jìn)行測(cè)定之前，根據(jù)需要稀釋上清液。 7. 固體或高蛋白樣本：稱取固體樣本，加入去離子水（1:2，W/V），冰浴勻漿，10,000 g，4℃離心10 min，取水溶性部分的上清液。不溶物部分用去離子水洗滌，將此洗滌液與水溶性的上清液混合，合并的上清液可以用1×Assay Buffer稀釋并直接用于分析。而不溶物部分加入純丙酮（1:4, w/v）在室溫下混合30-60 min來(lái)進(jìn)一步提取。10,000 g，4℃離心10 min，取丙酮提取物的上清液用50%丙酮稀釋。通過(guò)將水溶性部分和不溶物部分的丙酮提取物的結(jié)果相結(jié)合，計(jì)算出總HORAC值。 注意：該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1501的測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)步驟 1. 熒光酶標(biāo)儀預(yù)熱到37℃，調(diào)節(jié)激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。 2. 操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）： 試劑 空白孔（μL） 標(biāo)準(zhǔn)孔（μL） 測(cè)定孔（μL） 1×Assay Buffer 20 0 0 Standard 0 20 0 上清 0 0 20 1×ReagentⅠ 140 140 140 混勻，37℃孵育30 min 1×ReagentⅡ 20 20 20 ReagentⅢ 20 20 20 3. 混勻，立即用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光值，每5 min讀取1次，總共60 min。熒光酶標(biāo)儀的測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，儀器溫度保持在37℃。 注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。空白孔的最終測(cè)定值應(yīng)小于初始值的10%。 結(jié)果計(jì)算 HORAC值根據(jù)熒光衰減曲線下凈面積(Area Under the Curve, AUC)=[AUC待測(cè)樣(抗氧化劑)-AUC(空白)]計(jì)算抗氧化劑的活性。 1. 從下面的等式計(jì)算AUC AUC=1+RFU1/RFU0+RFU2/RFU0+RFU3/RFU0+……+RFU59/RFU0+RFU60/RFU0 RFU0=0 min的相對(duì)熒光值。 RFUx=x min的相對(duì)熒光值（例如，RFU5是5 min時(shí)的相對(duì)熒光值）。 2. 計(jì)算凈AUC：凈AUC=AUC(樣本)-AUC(空白)。 3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為y軸，凈AUC為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 4. 將樣本的凈AUC帶入方程得到y(tǒng)值（μM），以微摩爾每升Trolox當(dāng)量（TE）或每克樣品的TE（μmol TE/ g或μmol TE/ L）表示HORAC值。 注意：若樣本進(jìn)一步稀釋，則需要再乘以進(jìn)一步稀釋的稀釋倍數(shù)n。 結(jié)果展示 典型標(biāo)準(zhǔn)曲線： Figure 1. HORAC的標(biāo)準(zhǔn)曲線 示例： 取0.1 g植物組織加入1 mL 1×Assay Buffer進(jìn)行勻漿研磨，取上清，之后按照測(cè)定步驟操作，用全黑96孔板測(cè)得： 樣本的AUC為9.199，空白的AUC為1.937，凈AUC=AUC(樣本)-AUC(空白)=9.199-1.937=7.262，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=4.2835x-0.11，Trolox濃度為30.997 µM，HORAC值（樣本）=30.997 µM=30.997 µM TE=30.997 µmol TE/L。 |
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