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Abbkine亞科因新蟲 (初入文壇)
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Caspase-2活性分析試劑盒（比色法）實(shí)驗(yàn)操作步驟 已有1人參與
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原理 半胱氨酸蛋白酶的Caspase家族已顯示在凋亡中起關(guān)鍵作用。 哺乳動物Caspase可分為三個(gè)功能組：啟動子半胱天冬酶（Caspase-2、8、9和10），執(zhí)行者半胱天冬酶（Caspase-3、6和7）和炎性半胱天冬酶（Caspase-1、4、5、11 和 12）。Caspase-2屬于半胱氨酸蛋白酶家族，其僅在天冬氨酸殘基后的氨基酸切割蛋白質(zhì)。 在這個(gè)家族中，Caspase-2是Ich-1亞家族的一部分，它是不同動物物種中最保守的胱天蛋白酶之一。 它具有與啟動子半胱天冬酶類似的氨基酸序列，包括Caspase-1，Caspase-4，Caspase-5 和Caspase-9。它是作為酶原產(chǎn)生的，它包含一個(gè)與Caspase-9相似的長前結(jié)構(gòu)域，并含有一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用域的CARD結(jié)構(gòu)域。 Caspase-2前體（Pro-Caspase-2）包含兩個(gè)亞基，p19 和 p12。Caspase-2活性分析試劑盒（比色法）基于Caspase-2 水解肽底物 Ac-VDQQD-pNA（乙�；�- Val-Asp-Gln-Gln-Asp對硝基苯胺），產(chǎn)生黃色的對硝基苯胺（pNA），pNA在405 nm附近有強(qiáng)吸收,從而可以通過測定吸光度來檢測Caspase -2的活性。 自備耗材 ·酶標(biāo)儀（能測405 nm處的吸光度） ·96孔板 ·低溫離心機(jī)、制冰機(jī) ·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭 ·去離子水、磷酸鹽緩沖液 (PBS) ·勻漿器（如果是組織樣本） 試劑準(zhǔn)備 Working Cell Lysis Buffer: 使用前，立即加入DTT（最終濃度：每1 mL Cell Lysis Buffer加10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。 Working Reaction Buffer (1×): 使用前，用去離子水稀釋到Reaction Buffer (1×)，再加入DTT（最終濃度：每1 mL Reaction Buffer (1×)加10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。 Ac-VDQQD-pNA (4 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的試劑-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。 pNA(10 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃避光保存。用不完的試劑-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。 DTT(100×): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的試劑-20℃分裝保存，避免反復(fù)凍融。 Standard設(shè)置：用Reaction Buffer (1×，含DTT)將標(biāo)準(zhǔn)品pNA (10 mM)稀釋為200、100、50、20、10、0 µM的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 樣本制備 注意：我們建議使用新鮮樣品�；虬凑铡皹颖局苽洹睂悠繁４嬖�-80℃。使用前，在冰上解凍，這可能會影響樣品的穩(wěn)定性，并且讀數(shù)可能會低于預(yù)期。此試劑盒可檢測蛋白水解活性。在樣品制備步驟中請勿使用蛋白酶抑制劑，它可能會干擾測定。 1. 通過所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，建議對每個(gè)Caspase-2比色測定法設(shè)置不誘導(dǎo)的對照培養(yǎng)。 2. 對于貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。600 g，4℃離心5 min，小心吸去上清液。用1 mL PBS洗滌細(xì)胞2次。離心后，去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重懸1-5×106個(gè)細(xì)胞。 3. 對于懸浮細(xì)胞，600 g，4℃離心5 min，小心吸去上清液。用1 mL PBS洗滌細(xì)胞2次。離心后，去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重懸1-5×106個(gè)細(xì)胞。 4. 對于組織，將5-20 mg組織切成小塊，用PBS清洗組織，加入0.1 mL Working Cell Lysis Buffer，冰浴勻漿。 5. 裂解物冰上孵育15-20 min。 6. 16,000 g，4℃離心15 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新試管中，置冰上待測。 7. 立即測定Caspase-2的酶活性或-80℃保存樣品。同時(shí)可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度。 注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3002的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。 實(shí)驗(yàn)步驟 1.酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到405 nm。 2.操作表（下述操作在96孔板中操作）： 空白孔（μL） 標(biāo)準(zhǔn)孔（μL） 測定孔（μL） Working Reaction Buffer (1×，含DTT) 100 50 50 Standard 0 50 0 上清 0 0 50 Ac-VDQQD-pNA (4 mM) 5 5 5 3.混勻，37℃孵育1-2 h，檢測405 nm處吸光值�？瞻卓子洖锳空，標(biāo)準(zhǔn)孔記為A標(biāo)、測定孔記為A測。計(jì)算ΔA測=A測-A空，ΔA標(biāo)=A標(biāo)-A空。 注意：1.空白孔只需測定 1-2 次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)；2.在反應(yīng)體系中，適當(dāng)混勻，注意避免在混勻時(shí)產(chǎn)生氣泡；3.發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測定405 nm的波長。如果顏色變化不明顯，可以適當(dāng)延長孵育時(shí)間，甚至可以孵育過夜。 結(jié)果計(jì)算 注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。 1. 按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，ΔA標(biāo)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=kx+b。將樣本的ΔA測帶入方程得到x值（μM）。 2. 按酶活性增加百分比計(jì)算 Caspase-2活性增加百分比=(實(shí)驗(yàn)處理組A測定-A空白)/(實(shí)驗(yàn)對照組A測定-A空白)×100% 該方法簡單可靠，可粗略反應(yīng)酶活性情況。 3. 按酶活計(jì)算 參考 Chemicon公司的Caspase酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí),在37℃一個(gè)小時(shí)內(nèi)可以剪切1 nmol pNA底物產(chǎn)生1 nmol游離pNA的酶量。這樣就可以計(jì)算出樣品中含有多少個(gè)酶活力單位的Caspase酶活性。 Caspase-2活性（U/mg prot）=x×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×103=2.1×x÷Cpr÷T V反總：反應(yīng)體系總體積，0.105 mL=1.05×10-4 L；V樣：加入的樣本體積，0.05 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；103：單位換算系數(shù)，1 μmol =103 nmol。 注意：對于樣品中Caspase-2酶活力特別高的情況，須用Working Cell Lysis Buffer適當(dāng)稀釋樣品后再進(jìn)行測定。計(jì)算時(shí)再乘以稀釋的稀釋倍數(shù)n。 |
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2樓2025-01-31 09:47:26
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