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活性氧（ROS）含量檢測試劑盒實驗解決方案 已有1人參與
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實驗步驟 對于刺激時間較短（通常為2 h以內(nèi)）的細胞，建議先裝載探針，后用活性氧陽性對照或感興趣的藥物刺激細胞；對于需要較長時間刺激（通常為6 h以上）的細胞，建議先用活性氧陽性對照或感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針，此處僅提供后者的實驗方法，具體步驟如下： 1.原位裝載探針 (僅適用于貼壁細胞) a) 細胞準備：檢測前一天細胞鋪板，確保檢測時細胞數(shù)量小于5×105個/mL。 b) 藥物誘導：去除細胞培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的藥物處理細胞，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實際誘導時間根據(jù)藥物特性和細胞類型決定。 c) （選做）陽性對照：用無血清培養(yǎng)液稀釋Positive Control (50 mM) 到常用工作濃度50 μM，加入細胞，37℃避光孵育30 min-4 h。為提高活性氧水平，不同類型細胞刺激時間存在差異，例如：HeLa細胞需處理30-60 min。 注意：（1）僅在陽性對照孔中加入，其余試驗組不需要加陽性對照。（2）陽性對照推薦初始使用濃度為50 μM（推薦濃度50-250 μM，具體依細胞類型而定），工作液要現(xiàn)用現(xiàn)配，不要儲存稀釋后的溶液，陽性對照也可用不含酚紅的10% FBS完全培養(yǎng)基稀釋。 d) ROS探針準備：用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。 e) ROS探針裝載：去除處理藥物，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞1-2次，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA工作液。需充分蓋住細胞，例如：6孔板通常不少于1 mL/孔，96孔板通常不少于100 μL/孔，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。 f) 細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞1-2次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。 2.收集細胞后裝載探針 (適用于貼壁細胞和懸浮細胞) a) 細胞準備：按照標準方法培養(yǎng)細胞，必須保證檢測用細胞狀態(tài)良好。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。 b) 藥物誘導：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實際誘導時間可根據(jù)藥物特性和細胞類型決定。 c) （選做）陽性對照：用無血清培養(yǎng)液稀釋Positive Control (50 mM) 到常用工作濃度50 μM，加入細胞，37℃避光孵育30 min-4 h。為提高活性氧水平，不同類型細胞刺激時間存在差異，例如：HeLa細胞需處理30-60 min。 注意：（1）僅在陽性對照孔中加入，其余試驗組不需要加陽性對照。（2）陽性對照推薦初始使用濃度為50 μM（推薦濃度50-250 μM，具體依細胞類型而定），工作液要現(xiàn)用現(xiàn)配，不要儲存稀釋后的溶液，陽性對照也可用不含酚紅的10% FBS完全培養(yǎng)基稀釋。 d) ROS 探針準備：探針裝載前，用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。 e) ROS探針裝載：離心收集細胞去除處理藥物，并用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞1-2次，離心收集細胞，加入稀釋好的探針，使其細胞密度為1.0×106-2.0×107，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。 注意：細胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法以及檢測總量來進行調(diào)整。例如：對于流式分析，單管檢測內(nèi)細胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。 f) 細胞清洗：用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1-2次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。 3.熒光顯微拍照 a) 對貼壁生長細胞（步驟1.f)，細胞清洗后，加適量的無血清細胞培養(yǎng)液或PBS，在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮生長細胞（步驟2.f)，取25-50 μL細胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。 b) 熒光顯微鏡下，選用FITC濾光片觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。 4.流式細胞分析操作方法 a) 對貼壁生長細胞（步驟1.f)，用胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞（步驟2.f)，直接收集細胞。用0.5-1 mL PBS重懸細胞(0.5-1x105/mL)； b) 流式細胞儀中，488 nm為激發(fā)波長，525 nm為發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。 注意事項 1.陽性對照推薦初始使用濃度為50 μM（推薦濃度50-250 μM，具體依細胞類型而定）。通常刺激后30 min-4 h可以觀察到顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 min內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可延長誘導時間或適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果熒光信號過強，可縮短誘導時間或適當降低活性氧陽性對照的濃度。 2.實驗過程中，如果陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2,000-1:5,000稀釋熒光探針DCFH-DA，使DCFH-DA的終濃度為2-5 μM。探針裝載的時間可在15-60 min內(nèi)適當進行調(diào)整，盡量縮短讀片時的曝光時間，并且試驗組、對照組曝光時間需保持一致。 3.Positive Control (50 mM) 僅僅用于作為陽性對照的樣品，并非所有試驗組樣品中都需加入活性氧陽性對照。 4.探針裝載后，一定要洗凈未進入細胞內(nèi)的探針，否則會導致背景較高。 5.盡量縮短探針裝載后到檢測所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。 |
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